骨肉瘤类肿瘤干细胞诱导巨噬细胞M2表型分化的研究

发布时间：2017-05-17 18:18

  本文关键词：骨肉瘤类肿瘤干细胞诱导巨噬细胞M2表型分化的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤,目前临床治疗以手术治疗为主,辅以放化疗,但治疗效果仍不理想。肿瘤干细胞学说认为肿瘤复发难治的根源在于肿瘤中存在着肿瘤干细胞,目前多数学者认为CD133和CD44为骨肉瘤类肿瘤干细胞表面标志。有研究表明肺腺癌类肿瘤干细胞表面β1,6分支N-糖链表达异常增加,而乳腺癌表面的β1,6分支N-糖链缺失可以诱导巨噬细胞发生M1型表型转换,使其发挥抗肿瘤作用。然而,p1,6分支N-糖在骨肉瘤中的作用却鲜有报道。基于此,本研究拟检测骨肉瘤类肿瘤干细胞表面N糖苷表达情况,并研究其对巨噬细胞表型转换的影响,以期进一步阐明骨肉瘤肿瘤免疫逃逸机制,为骨肉瘤的免疫治疗奠定基础。方法：1.通过无血清培养法培养小鼠骨肉瘤细胞株LM8,初步获得骨肉瘤悬浮细胞球,通过磁珠细胞分选的办法,通过二次阳性分选得到CD133及CD44双阳性的LM8细胞。通过流式细胞术检测分选后细胞表面CD133分子及CD44分子的表达情况。2.使用不同剂量的N糖基化抑制剂苦马豆素处理分选得到的骨肉瘤类肿瘤干细胞,通过凝集素结合实验检测细胞表面β1,6分支N-糖链的表达水平。3.获取小鼠骨髓细胞,加入GM-CSF诱导其中单核细胞向巨噬细胞分化,8日后流式细胞术检测细胞表面巨噬细胞表面特异性分子F4/80的表达水平。4.将不同浓度苦马豆素处理之后的骨肉瘤类肿瘤干细胞与小鼠骨髓来源的巨噬细胞共同培养,荧光实时定量PCR法检测巨噬细胞中iNOS和Arg-1的RNA表达水平,精氨酸酶活性检测试剂盒检测巨噬细胞培养上清中精氨酸酶活性,ELISA法检测巨噬细胞培养上清中TNF-a和IL-10含量。结果：1.流式细胞术检测结果表明,通过无血清培养初步分离后再进行磁珠分选得到的的细胞中CD133和CD44双阳性细胞比例为96.5±1.2%。该结果表明我们成功分离得到骨肉瘤类肿瘤干细胞。2.凝集素结合实验显示,骨肉瘤类肿瘤干细胞与L-PHA具有更高的结合率,达90.3±2.1%,高于LM8细胞的结合率54.3±3.1%,差异具有统计学意义(P0.05)。用lmg/mL的苦马豆素处理骨肉瘤类肿瘤干细胞后,细胞表面β1,6分支N-糖链的表达阳性率为90%,用5mg/mL的苦马豆素处理骨肉瘤类肿瘤干细胞后,细胞表面β1,6分支N-糖链的表达阳性率为21%,以上结果表明随着苦马豆素剂量的增加,骨肉瘤类肿瘤干细胞表面β1,6分支N-糖链的表达阳性率降低。3.流式细胞术检查结果显示,骨髓来源巨噬细胞经过诱导培养8天后,F4/80阳性细胞率为95.4%,表明骨髓来源巨噬细胞培养成功。4.骨肉瘤类肿瘤干细胞与骨髓巨噬细胞共培养48小时后,与单独巨噬细胞相比,共培养后的巨噬细胞内Arg-1的mRNA表达量上升(40±2.6% v.s.4±2.6%,P0.05), iNOS mRNA表达量无显著差异(12±1.3% v.s.8±4.6%,P0.05),共培养上清中IL-10含量上升(150±6.8pg/mL v.s.50±3.8pg/mL, P0.05), TNF-a含量无显著差异(50±3.3pg/mL v.s.55±4.8pg/mL, P0.05),该结果表明与骨肉瘤类肿瘤干细胞培养后,巨噬细胞中M2型标记分子Arg-1和IL-10表达上升,M1型标记分子iNOS与TNF-a表达无显著变化,表明骨肉瘤类肿瘤干细胞诱导巨噬细胞向M2型分化。当我们用苦马豆素(1mg/mL)处理后的骨肉瘤类肿瘤干细胞与骨髓巨噬细胞共孵育后,与未处理的骨肉瘤类肿瘤干细胞相比,巨噬细胞中M2型标记分子Arg-1(12±3.1%v.s.40±2.6%, P0.05)和IL-10(90±4.4 pg/mL v.s.150±6.8 pg/mL,P0.05)表达下降,M1型标记分子iNOS(50±2.1%v.s.12±1.3%, P0.05)TNF-a与(240±8.1pg/mL v.s.50±3.3pg/mL, P0.05)表达上升,且该变化随着苦马豆素浓度的提高而进一步增强。结论：骨肉瘤类肿瘤干细胞表面高表达β1,6分支N-糖链,苦马豆素可以降低其细胞表面β1,6分支N-糖链的表达。骨肉瘤类肿瘤干细胞可以诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞向M2型分化,当用苦马豆素降低骨肉瘤类肿瘤干细胞表面N糖苷的表达后其诱导巨噬细胞向M2型分化的能力减弱。针对β1,6分支N-糖链合成的各类抑制剂,如苦马豆素,有望成为一种新的治疗骨肉瘤的辅助药物。
【关键词】：骨肉瘤 肿瘤干细胞 N糖基化 巨噬细胞
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R738.1
【目录】：

• 中文摘要9-11
• 英文摘要11-14
• 引言14-17
• 第一部分 骨肉瘤类肿瘤干细胞的培养、分离及鉴定17-24
• 1.实验材料17-18
• 2 实验方法18-19
• 3 实验结果19-20
• 讨论20-24
• 第二部分 骨肉瘤类肿瘤干细胞表面糖链表达检测24-30
• 1.实验材料24-25
• 2 实验方法25-26
• 3 实验结果26-27
• 讨论27-30
• 第三部分 小鼠骨髓来源巨噬细胞培养及鉴定30-34
• 1 小鼠骨髓来源巨睡细胞培养30-31
• 2 实验方法31-32
• 3 实验结果32
• 讨论32-34
• 第四部分 骨肉瘤类肿瘤干细胞对巨噬细胞表型影响的研究34-44
• 1 实验材料34-35
• 2 实验方法35-40
• 3 实验结果40-41
• 讨论41-44
• 全文总结44-45
• 参考文献45-52
• 综述一52-74
• 参考文献63-74
• 综述二74-101
• 参考文献89-101
• 攻博期间发表和待发表的论文101-102
• 致谢102

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李健,郭卫,杨荣利,曲华毅,樊瑞峰;影响骨肉瘤预后因素的探讨[J];中国骨肿瘤骨病;2004年06期

2 鲍同柱,赵红卫,郑启新,刘万军,刘勇;反义转化生长因子-β1基因对骨肉瘤细胞表达转移相关因子的影响[J];中华实验外科杂志;2005年04期

3 牛聚伟;吴刚;祝少博;漆白文;钱炜;喻爱喜;;血管扩张刺激磷蛋白与骨肉瘤细胞迁移能力的关系[J];武汉大学学报(医学版);2012年06期

4 孟令祥,于锡欣,杜德利,王冠忠;P~(16)基因在骨肉瘤中的表达[J];山东医药;1999年06期

5 林娜,蔡宣松,梅炯;骨肉瘤预后因素探讨[J];实用肿瘤杂志;2000年05期

6 姜文学,董天华,吴士良,马文雄;骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞的诱导及其抗肿瘤特性的研究[J];中华骨科杂志;2000年01期

7 马忠泰,栗怀广,施学东;骨肉瘤的化疗与疗效判断[J];中华骨科杂志;2000年S1期

8 岳文,杨连甲,马明,董绍忠;体内和体外实验观察骨形成蛋白在骨肉瘤中的作用[J];口腔颌面外科杂志;2000年03期

9 姜文学,董天华,吴士良,马文雄;体外诱导骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞的实验研究[J];中国矫形外科杂志;2000年03期

10 郭乔楠,陈意生;骨肉瘤细胞增殖活性的测定及其与预后的关系[J];中国现代医学杂志;2000年12期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 李红;龙勉;;力学微扰对骨肉瘤细胞生物学行为的影响[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年

2 金先庆;罗小辑;;骨肉瘤细胞骨分化标志检测及临床意义[A];中国抗癌协会第七届全国小儿肿瘤学术会议论文汇编[C];2007年

3 李进;杨述华;邹利军;邵增务;廖翔;;单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及其对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用[A];泛长江流域骨科新进展暨第九届全国骨科护理研讨会论文汇编[C];2007年

4 李进;杨述华;邹利军;邵增务;廖翔;;单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及其对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用[A];第八届全国脊柱脊髓损伤学术会议论文汇编[C];2007年

5 胡宏伟;孙其志;;骨肉瘤的治疗进展[A];第十七届中国康协肢残康复学术年会暨第三届海峡两岸OS会议论文汇编[C];2008年

6 于秀淳;王伟;;影响骨肉瘤新辅助化疗疗效的多因素分析[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议教育集[C];2006年

7 张瑶;;四肢长骨骨肉瘤合并病理性骨折围手术期的护理[A];全国肿瘤护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2006年

8 张瑶;;四肢长骨骨肉瘤合并病理性骨折围手术期的护理[A];全国第八届骨科护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2006年

9 张志明;;外伤诱发骨肉瘤一例分析[A];第四次全国法医学术交流会论文集（上卷）[C];1991年

10 杨迪生;解先宽;叶招明;陶惠民;;反义C-myc重组腺病毒的构建及其抗骨肉瘤细胞作用的实验研究[A];2004年浙江省骨科学术会议论文汇编[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前2条

1 任勇 李运红 胡颜;莫名关节痛青少年警惕骨肉瘤[N];天津日报;2006年

2 黄金昶;骨肉瘤可试用斑蝥治疗[N];健康报;2005年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 刘巍;UHRF1在骨肉瘤细胞侵袭过程中的作用及其机制研究[D];山西医科大学;2015年

2 陈杰;HDAC5在骨肉瘤细胞增殖中的表观遗传学调控研究[D];复旦大学;2014年

3 马万里;miR-148a在骨肉瘤患者体内的表达及其功能机制的研究[D];山东大学;2015年

4 田吉光;CD271~+骨肉瘤干细胞特性研究及以DNA-PK为靶点逆转骨肉瘤化疗耐药性的研究[D];山东大学;2015年

5 成功;内脏脂肪素对U2OS细胞株迁移与侵袭的影响及其机制的实验研究[D];南方医科大学;2015年

6 方永超;环氧化酶-2和miR-143在骨肉瘤中的表达和临床意义[D];南方医科大学;2015年

7 赵健;microRNA-21在骨肉瘤细胞MG63中作用机制的研究[D];第四军医大学;2015年

8 韩康;microRNA-194在骨肉瘤中作用及机制的研究[D];第四军医大学;2015年

9 朱U，

本文编号：374159