SPNS2在Borrmann 4型胃癌中的调控作用及分子机制探究

发布时间：2023-03-20 02:48

　　目的:在我国,胃癌的发病率和病死率均居恶性肿瘤的第2位,严重威胁着人们的生命健康,且发病率无明显下降趋势。绝大多数胃癌起病隐匿,早期并无明显的临床症状,或出现非特异性症状(如恶心、嗳气、食欲缺乏及上腹不适等)而被忽略,所以胃癌的早期诊断率仍较低,大多数患者在就医时往往已经错过治疗的最佳时期。虽然以胃癌D2根治术为基础的肿瘤规范化治疗正在被广泛推广应用,但我国胃癌患者的5年生存率仍然只有50%左右。Borrmann 4型胃癌被认为是最特殊的一类胃癌,又称弥漫型癌,它与一般胃癌不同,Borrmann 4型胃癌往往生长较为迅速,可以很快便向整个腹腔播散转移,初诊时往往即有腹膜播散。所以Borrmann 4型胃癌手术切除率低,而且实行根治手术后腹膜复发转移多见,预后较其他Borrmann分型胃癌差。因此,深入研究Borrmann4型胃癌的发生发展机制,寻找关键生物标志物和良好的治疗靶点对于预防和治疗Borrmann 4型胃癌有重要意义。鞘氨醇-1-磷酸转运体(Spinster homolog 2,SPNS2)是SPNS/Spinster家族成员之一,是一种膜转运蛋白,其可以利用物质在细胞膜内外...

【文章页数】：124 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分:高通量测序技术初步筛查Borrmann4 型胃癌研究的候选基因及网络数据库初步验证、分析
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
            2.1.3 主要试剂配制
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 细胞系STR鉴定
            2.2.3 高通量转录组测序
            2.2.4 数据分析
            2.2.5 利用网络数据库在线分析工具分析候选基因
            2.2.6 总RNA抽提
            2.2.7 反转录获得cDNA
            2.2.8 Real-time PCR检测
            2.2.9 数据分析
            2.2.10 细胞蛋白样本的提取
            2.2.11 BCA法测定蛋白浓度
            2.2.12 SDS-PAGE电泳
            2.2.13 湿法免疫印迹杂交
            2.2.14 显影
    3 结果
        3.1 OCUM-1 细胞系和AGS细胞系STR鉴定结果
        3.2 高通量测序分析结果
            3.2.1 测序质控
            3.2.2 比对结果统计
            3.2.3 基因和转录本表达定量分析
            3.2.4 样本相关性分析
            3.2.5 差异表达基因聚类分析
            3.2.6 差异表达基因散点图
            3.2.7 差异表达基因GO分析
            3.2.8 差异表达基因Pathway分析
            3.2.9 初步筛选出要研究的候选基因
            3.2.10 网络数据库在线分析工具初步分析候选基因
            3.2.11 Real-time PCR法检测人胃癌细胞系及人正常胃粘膜细胞系中4 个候选基因的mRNA含量错误
            3.2.12 Western Blot检测在不同分化程度胃癌细胞系和正常胃粘膜细胞系中2个候选基因的蛋白表达水平
    4 讨论
    5 结论
第二部分:SPNS2在Borrmann4 型胃癌的表达及预后意义
    6 前言
    7 材料和方法
        7.1 主要试剂和仪器
            7.1.1 主要试剂
            7.1.2 主要仪器
        7.2 实验方法
            7.2.1 网络数据库在线分析工具 Kaplan-Meier plotter 分析
            7.2.2 免疫组化实验研究对象和分组
            7.2.3 免疫组化实验—脱蜡水化
            7.2.4 免疫组化实验—灭活内源性过氧化物酶
            7.2.5 免疫组化实验—热抗原修复
            7.2.6 免疫组化染色
            7.2.7 免疫组化评分
            7.2.8 免疫组化实验数据分析
    8 结果
        8.1 Kaplan Meier-plotter分析结果
        8.2 SPNS2 在胃癌组织与癌旁正常组织中的表达差异
        8.3 SPNS2在Borrmann4 型胃癌组织与其它Borrmann类型胃癌组织的表达差异
        8.4 SPNS2 表达与临床病理特点的关系
        8.5 SPNS2 表达与预后的关系
        8.6 SPNS2 表达与Borrmann4 型胃癌病例的临床病理特点的关系
        8.7 SPNS2 表达与Borrmann4 型胃癌病例预后的关系
    9 讨论
    10 结论
第三部分:SPNS2对Borrmann4 型胃癌生物学行为的调控作用及机制
    11 前言
    12 材料和方法
        12.1 主要试剂和仪器
            12.1.1 主要试剂
            12.1.2 主要仪器
            12.1.3 主要试剂配制
        12.2 实验方法
            12.2.1 细胞培养
            12.2.2 SPNS2 敲减病毒感染人胃癌细胞系OCUM-1
            12.2.3 细胞总RNA提取、反转录,QT-PCR检测不同设计靶点慢病毒转染敲减SPNS2 后的表达,判断慢病毒转染后敲减SPNS2 的效率
            12.2.4 Western Blot检测蛋白水平慢病毒转染后敲减SPNS2 的效率
            12.2.5 细胞侵袭实验
            12.2.6 细胞迁移实验
            12.2.7 细胞增殖与活力实验(CCK8)法
            12.2.8 流式细胞仪检测细胞周期
            12.2.9 流式细胞仪检测细胞凋亡(Annexin V-FITC双染法)
            12.2.10 RT-PCR技术检测细胞相关指标mRNA水平
            12.2.11 Western Blot检测细胞相关指标蛋白表达
            12.2.12 统计分析
    13 结果
        13.1 稳定低表达SPNS2的OCUM-1 细胞系的建立
        13.2 敲减内源性SPNS2 表达抑制OCUM-1 的侵袭能力
        13.3 敲减内源性SPNS2 表达抑制OCUM-1 的迁移能力
        13.4 CCK-8 实验评估敲减内源性SPNS2 表达对OCUM-1 增殖能力的影响..
        13.5 流式细胞技术检测细胞周期实验评估敲减内源性SPNS2 表达对OCUM-1细胞周期的影响
        13.6 流式细胞技术检测细胞凋亡实验评估敲减内源性SPNS2 表达对OCUM-1凋亡的影响
        13.7 敲减内源性SPNS2 表达后OCUM-1 细胞EMT相关因子及侵袭相关因子的mRNA含量变化
        13.8 敲减内源性SPNS2 表达后OCUM-1 细胞PI3K/AKT通路相关因子的mRNA含量变化
        13.9 敲减内源性SPNS2 表达后OCUM-1 细胞EMT相关因子及侵袭相关因子的蛋白表达变化
        13.10 敲减内源性SPNS2 表达后OCUM-1 细胞PI3K/AKT通路相关因子的蛋白表达变化
    14 讨论
    15 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述 鞘氨醇-1-磷酸转运体研究现状
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简介



本文编号：3766530