胆管瘢痕差异蛋白研究及Activin B在UDCA治疗瘢痕中作用的研究

发布时间：2017-05-19 00:08

  本文关键词：胆管瘢痕差异蛋白研究及Activin B在UDCA治疗瘢痕中作用的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[研究目的]从蛋白质转录水平研究良性胆管增生性瘫痕形成的分子机理,同时为胆管增生性瘢痕的发病机制研究提供线索,为临床研究和治疗胆管增生性瘢痕提供实验室依据。[研究方法]1.原代培养人肝内胆管正常成纤维细胞和瘢痕成纤维细胞,MTT检测正常及瘢痕成纤维细胞生长情况；2.蛋白芯片检测胆管正常成纤维细胞和瘢痕成纤维细胞差异蛋白,对差异蛋白进行Pathway分析和GO功能注释,从中选取Act B、 TGF-β1、ET-1、Tsp-1和OSM作为后续实验目标蛋白；3. ELISA验证胆管瘢痕组织差异蛋白；4. siRNA-Act B转染瘢痕成纤维细胞,RT-PCR检测Act B mRNA表达,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western-blot检测差异蛋白表达；5.重组人Act B蛋白干预正常成纤维细胞,流式细胞仪检测细胞周期,Western-blot检测差异蛋白表达；6.MTT检测12种胆汁酸对瘢痕成纤维细胞活力的影响；7.流式细胞仪检测胆酸、脱氧胆酸对瘢痕成纤维细胞周期的影响；8.细胞计数、MTT和划痕愈合实验检测胆酸和脱氧胆酸联合对瘢痕成纤维细胞活力的影响；9.流式细胞仪检测熊脱氧胆酸对瘢痕成纤维细胞凋亡的影响；10.Western-blot检测熊脱氧胆酸对瘢痕成纤维细胞差异蛋白的影响；11.用熊脱氧胆酸喂食胆总管瘢痕狭窄模型的家兔,连续观察30天、90天和180天；12.检测熊脱氧胆酸对血清肝功能的影响；13.HE染色和Masson染色分别观察熊脱氧胆酸对瘢痕增生指数和胶原纤维面密度的影响；14.免疫组织化学法检测熊脱氧胆酸对瘢痕组织Act B和Smad2/3表达的影响；15.Western-blot检测熊脱氧胆酸对瘢痕组织差异蛋白表达的影响。[研究结果]1.原代培养的正常成纤维细胞和瘢痕成纤维细胞细胞形态不同,vimentin免疫荧光检测二者细胞都为阳性表达,瘢痕成纤维细胞生长速度明显快于正常成纤维细胞；2.蛋白芯片检测507个蛋白,共发现有37个差异蛋白,与正常成纤维细胞相比,在瘢痕成纤维细胞中表达上调的蛋白有27个,表达下调的蛋白有10个(P0.05),其功能与细胞外基质的合成与降解、细胞因子的生成和激活、炎症免疫反应、组织损伤反应、细胞周期、细胞迁移、细胞凋亡、细胞分泌和结合激活素等有关；3.ELISA验证Act B、TGF-β1、ET-1、Tsp-1和OSM蛋白表达情况符合蛋白芯片的结果；4. siRNA-Act B干扰组Act B mRNA表达量显著下降(P0.01)。干扰组早期凋亡、晚期凋亡及坏死百分比升高(P0.01)。干扰组Act B、Smad2/3和TGF-β1蛋白表达量降低(P0.05),其中TGF-β1 (P0.01),而干扰组Tsp-1和OSM蛋白表达量升高(P0.05),其中OSM (P0.01);5.重组人Act B蛋白过表达组细胞周期G0/G1期百分比降低,S期百分比上升(P0.05)。过表达组Act B、Smad2/3和TGF-β1蛋白表达量升高(P0.05),而过表达组Tsp-1和OSM蛋白表达量显著降低(P0.01)；6.胆汁酸浓度在0.5-5μmol/L之间时,仅胆酸和脱氧胆酸促进瘢痕成纤维细胞活力(P0.05),其他胆汁酸对瘢痕成纤维细胞的活力无明显影响(P0.05),浓度在20-500μmol/L,绝大多数胆汁酸都抑制了瘢痕成纤维细胞的活力(P0.05)；7.胆酸、脱氧胆酸使瘢痕成纤维细胞G0/G1期百分比降低,S期百分比上升(P0.05)；8.胆酸和脱氧胆酸联合干预瘢痕成纤维细胞,联合组细胞计数和细胞活力增加,划痕愈合距离缩小(P0.05)；9.熊脱氧胆酸促进瘢痕成纤维细胞凋亡；10.熊脱氧胆酸抑制瘢痕成纤维细胞Act B、Smad2/3和TGF-β1蛋白表达量(P0.05),升高Tsp-1和OSM蛋白表达(P0.05)；11.胆总管瘢痕狭窄模型制备成功；12.熊脱氧胆酸能适度改善血清肝功能指标；13.熊脱氧胆酸能轻度减少瘢痕增生指数和胶原纤维面密度；14.180d观察发现UDCA组与瘢痕组Act B和Samd2/3总体评分分布有统计学差异(P0.05),且服药与总体评分有相关性。30d、90d和180天连续观察发现Act B和Samd2/3总体评分随时间推移而减少(P0.05),时间长短与总体评分有相关性；15.熊脱氧胆酸抑制瘢痕组织Act B、Smad2/3、TGF-β1和ET-1蛋白表达(P0.05),升高Tsp-1蛋白表达(P0.05)。[研究结论]1.人肝内胆管瘢痕成纤维细胞和正常成纤维细胞存在蛋白表达差异,其中Activin B、TGF-β1、ET-1、Tsp-1和OSM与瘢痕形成有关。2. Activin B信号在胆管正常成纤维细胞向瘢痕成纤维细胞转化过程中起着重要作用,TGF-β1、Smad2/3、Tsp-1和OSM是重要的参与者。3.低浓度的胆酸和脱氧胆酸可促进瘢痕成纤维细胞生长。4. UDCA可抑制瘢痕成纤维细胞的生长,促进其凋亡。其机制是通过ActivinB信号调控TGF-β1、Smad2/3、Tsp-1和OSM蛋白的表达。5. UDCA可适度改善良性胆总管瘢痕狭窄动物肝功能、瘢痕增生指数、胶原纤维面密度指标,且改善程度与时间长短相关。其机制是通过Activin B信号调控TGF-β1、Smad2/3、ET-1和Tsp-1蛋白的表达。
【关键词】：胆管 瘢痕 成纤维细胞 熊脱氧胆酸 Activin B
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R657.4
【目录】：

• 英文缩写一览表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 引言14-16
• 第一部分 人肝内胆管正常成纤维细胞和瘢痕成纤维细胞的体外培养及差异蛋白研究16-72
• 前言16
• 材料与方法16-38
• 结果38-60
• 讨论60-66
• 结论66-67
• 参考文献67-72
• 第二部分 胆汁酸对人肝内胆管瘢痕成纤维细胞生长影响的研究及熊脱氧胆酸对瘢痕成纤维细胞生长影响机制的探讨72-95
• 前言72
• 材料与方法72-79
• 结果79-85
• 讨论85-90
• 结论90-91
• 参考文献91-95
• 第三部分 熊脱氧胆酸对家兔良性胆总管瘢痕狭窄的影响及机制探讨95-118
• 前言95
• 材料与方法95-103
• 结果103-112
• 讨论112-114
• 结论114-115
• 参考文献115-118
• 全文总结118-119
• 文献综述119-130
• 参考文献125-130
• 攻读博士学位期间主要研究成果130-131
• 致谢131

【引证文献】

中国重要会议论文全文数据库 前2条

1 柴成伟;魏明发;冯杰雄;吴晓娟;郑帅玉;王小林;;环氧化酶-2在甘氨鹅脱氧胆酸钠致胆管上皮细胞癌变中的机理研究[A];中华医学会第八次全国小儿外科学术会论文集[C];2010年

2 贺伟峰;吴军;罗高兴;甘成军;程文广;袁顺宗;彭旭;贾雄飞;谭江琳;王晓娟;胡婕;黄正根;杨世伟;陈希炜;张小容;;增生性瘢痕组织和正常皮肤来源的成纤维细胞分泌蛋白的差异蛋白质组学研究[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

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本文编号：377389