基于基因组学技术的脊索瘤致病分子通路和亚分类研究

发布时间：2017-05-19 09:14

  本文关键词：基于基因组学技术的脊索瘤致病分子通路和亚分类研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脊索瘤(chordoma)是一种罕见的骨癌,是由残留在脊柱中的脊索细胞癌变产生的。脊索瘤的年发病率约为百万分之一,使得较难收集大量样本,并且由于脊索组织是胎儿发育阶段特异存在的,所以取得病人的癌组织样本的同时无法获取癌旁组织做对照,这些困难导致脊索瘤的基因组学研究落后于常见肿瘤。T基因是脊索瘤研究中最受关注的基因,它所在区域的拷贝数扩增是家族性脊索瘤发病的原因,并且T基因外显子区域的SNP rs2305089与散发脊索瘤的发病显著相关(P=4.4×10-9,OR=6.1),尽管存在人群异质性。研究显示T基因编码的蛋白brachyury的表达量与脊索瘤的预后不相关,并且不同的研究发现了不一致的结果。因此,继续探索T基因与脊索瘤的关系、并定位新的与脊索瘤发病相关的基因和信号通路,对揭示脊索瘤的发病机制仍然十分必要。本研究利用流产胎儿的脊索组织作为对照,通过两例脊索瘤和两例脊索组织样本的miRNA和mRNA转录组测序,对差异表达的基因做通路富集分析,发现TGFβ信号通路被显著富集并且处于被抑制状态,通过3例脊索瘤的外显子组测序发现TGFβ信号通路中TRAF6基因的两个调控基因存在体细胞突变。我们通过分析转录组数据发现TGFβ3基因是TGFβ信号通路中下调表达最显著的基因,同时抑制该基因的miR-29显著地上调表达,提示了TGFβ3和miR-29对TGFβ信号通路被抑制起到重要作用。接下来我们利用qPCR的方法,在8例脊索瘤和8例脊索组织中检测TGFβ3和miR-29的表达水平,其中TGFβ3的表达水平在脊索瘤中显著低于脊索中,miR-29在脊索瘤中显著的高表达。TGFβ3与miR-29的表达水平成负相关,相关系数R2=0.87,提示TGFβ3的下调主要是由于miR-29的上调引起的。在这些脊索瘤组织和配对的血液样本的比较中发现,有超过一半的样本在TGFβ3和miR-29所在的基因组区域分别存在拷贝数缺失和拷贝数扩增,这对二者的异常表达可能也有影响。在脊索瘤细胞系UM-Chor1中用TGFβ3处理,从第8天开始处理组的细胞增殖速率显著低于对照组,提示TGFβ3可以抑制脊索瘤细胞的增殖。在斑马鱼受精卵中,用吗啉代寡核苷酸(Morpholino Oligonucliotide, MO)注射的方法敲低TGFβ3水平,48小时后斑马鱼幼鱼出现躯干弯曲的异常表型。通过苏木素-伊红(haematoxylin and eosin, HE)染色观测到斑马鱼脊索组织区细胞形态异常并增生。通过脊索组织特异表达的标记蛋白brachyury的免疫组化切片,观测到脊索区域异常的细胞中有brachyury的表达,证明这些细胞来源于脊索组织,说明敲低TGFβ3在斑马鱼中诱导产生了脊索瘤表型,本研究首次定位并证明了TGFβ3在脊索瘤发病中的关键作用。另外,通过微滴数字PCR(Droplet Digital PCR)的方法,我们对22例脊索瘤组织、3个脊索瘤细胞系和9例脊索组织中T基因两种不同的可变剪切体(T-long和T-short)绝对表达水平进行了检测,发现T-long为脊索瘤组织中的主要表达的形式,这明显不同于脊索,提示可变剪切表达模式的改变可能与脊索瘤是相关的。通过全基因组甲基化分型芯片检测9例经典型脊索瘤样本,聚类结果显示脊索瘤可分为两个亚类,其中亚类2与正常组织更加相近,并且两个亚类在临床影像检测结果和细胞病理结果中也存在不同,提示了经典型脊索瘤在分子水平还可以继续分成不同的亚类。
【关键词】：脊索瘤 TGFβ3 TGFβ信号通路 T基因 亚分类
【学位授予单位】：中国科学院北京基因组研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R738
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 专业词汇中英文对照表10-15
• 第一章 引言15-29
• 一、概述15-16
• 二、脊索瘤相关研究综述16-24
• 1、脊索瘤是起源于脊索组织的罕见肿瘤16-19
• 2、脊索瘤基因组水平研究落后于常见肿瘤19-22
• 3、脊索瘤转录组水平研究面临的挑战22-23
• 4、脊索瘤分子水平亚分类研究尚未开展23-24
• 三、肿瘤基因组学研究方法概述24-29
• 1、肿瘤是基因组疾病24-25
• 2、利用芯片技术研究肿瘤基因组25
• 3、利用第二代测序技术研究肿瘤基因组25-27
• 4、肿瘤致病候选基因的验证27-29
• 第二章 脊索瘤的基因组和转录组研究29-53
• 一、研究背景29
• 二、脊索瘤致病关键分子通路研究29-50
• 1、材料和方法29-34
• 1.1 研究样本29-30
• 1.2 样本基因组DNA提取30
• 1.3 样本总RNA提取30
• 1.4 反转录合成cDNA30-31
• 1.5 外显子组测序31
• 1.6 外显子组数据比对分析和变异检测31
• 1.7 mRNA转录组测序和比对分析31-32
• 1.8 miRNA转录组测序和分析32
• 1.9 整合miRNA和mRNA数据分析32
• 1.10 候选基因TGFβ3表达量检测32-33
• 1.11 新miRNA克隆测序验证33
• 1.12 候选miRNA表达量检测33
• 1.13 体细胞突变验证33
• 1.14 体细胞CNV检测33-34
• 1.15 细胞系增殖检测34
• 1.16 在斑马鱼中敲低TGFβ334
• 2、研究结果34-50
• 2.1 样本信息34-35
• 2.2 外显子测序数据概况35
• 2.3 脊索瘤属于体细胞突变数目较少的肿瘤类型35-36
• 2.4 转录组测序数据概况36-37
• 2.5 在chromosome 2q36.3区域鉴定出一个新的miRNA37
• 2.6 差异表达基因分析37-39
• 2.7 TGFp信号通路被显著富集并处于抑制状态39-41
• 2.8 扩大样本量验证差异表达的miRNA和mRNA41-45
• 2.9 TGFβ3处理可显著抑制脊索瘤细胞系增殖45-47
• 2.10 敲低TGFβ3可诱导斑马鱼产生脊索瘤47-48
• 2.11 TGFβ3和miR-29基因区域分别发生体细胞拷贝数缺失和扩增48-50
• 三、小结与讨论50-53
• 第三章 脊索瘤标记基因T的可变剪切体表达水平研究53-61
• 一、研究背景53-54
• 二、T基因可变剪切体表达水平研究54-59
• 1、材料和方法54-55
• 1.1 研究样本54
• 1.2 微滴数字PCR54
• 1.3 Western Blot实验54-55
• 1.4 rs2305089基因型检测55
• 1.5 统计分析55
• 2、结果55-59
• 2.1 样本信息55-56
• 2.2 T基因的两种可变剪切体在脊索和脊索瘤中的表达模式显著不同56-58
• 2.3 在蛋白质表达水平T-long在脊索瘤中占主导58-59
• 2.4 rs2305089与T基因的可变剪切无显著相关性59
• 三、小结与讨论59-61
• 第四章 基于全基因组甲基化分型数据的脊索瘤亚分类研究61-69
• 一、研究背景61-62
• 二、利用甲基化分型芯片研究脊索瘤亚分类情况62-66
• 1 、材料和方法62
• 1.1 研究样本62
• 1.2 甲基化芯片分型62
• 1.3 甲基化芯片数据分析62
• 2、结果62-66
• 2.1 样本信息62-63
• 2.2 通过聚类分析发现经典新脊索瘤存在两个亚类63-64
• 2.3 两个亚类之间差异基因富集到胞外基质相关通路64
• 2.4 两个亚类间的临床表型存在不同64-65
• 2.5 原发脊索瘤甲基化水平低于复发脊索瘤65-66
• 三、小结与讨论66-69
• 参考文献69-87
• 附录87-99
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果99

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  本文关键词：基于基因组学技术的脊索瘤致病分子通路和亚分类研究，由笔耕文化传播整理发布。

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