p53相互作用蛋白CCDC106和ZCCHC10在癌症中的作用及分子机制

发布时间：2023-05-12 22:08

　　研究背景:p53功能障碍是导致肿瘤发生的重要原因。p53基因突变是p53功能失活的主要方式,在所有癌症病例中约有一半发生p53基因突变。在没有发生p53基因突变的肿瘤细胞中,p53正调控因子的表达下调或/和负调控因子的过度激活也可以导致野生型p53功能失活。本研究室前期发现CCDC106可以促进p53蛋白的降解,而ZCCHC10可以抑制p53蛋白的降解。本论文进一步对CCDC106和ZCCHC10在癌症组织中的表达及其对癌症发生发展的作用进行研究。研究方法:利用荧光定量PCR方法和Western blot实验分别检测基因的mRNA和蛋白质表达量。采用慢病毒系统构建基因过表达和干扰的稳定细胞株。采用免疫共沉淀法和GST-pull down检测蛋白相互作用。核质分离和免疫荧光染色检测蛋白亚细胞定位。磷酸化抗体检测蛋白质的磷酸化。MTT法测定细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,平板集落形成实验检测细胞增殖能力,伤口愈合实验检测细胞迁移能力,TransWell侵袭实验检测细胞侵袭能力。采用皮下移植瘤小鼠模型研究CCDC106或ZCCHC10对体内肿瘤生长的影响。采用尾静脉注射小鼠模型研究Z...

【文章页数】：117 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 p53作为转录因子发挥抑癌功能
        1.1.1 p53蛋白的结构
        1.1.2 p53调控细胞周期和凋亡
        1.1.3 p53抑制肿瘤细胞侵袭和转移
    1.2 p53基因突变是癌症中最常见的突变
        1.2.1 p53突变的热点和频率
        1.2.2 突变对p53功能的影响
    1.3 MDM2介导p53泛素化是野生型p53失活的主要因素
        1.3.1 p53蛋白质的泛素化主要被MDM2调控
        1.3.2 调控p53泛素化降解的其它E3连接酶
        1.3.3 调控p53去泛素化的相关途径
        1.3.4 和p53泛素化降解有关的蛋白
    1.4 本论文的研究思路和研究意义
第二章 CCDC106在乳腺癌和宫颈癌中的作用及分子机制
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验材料
            2.2.1.1 细胞株和菌株
            2.2.1.2 载体和工具酶
            2.2.1.3 主要试剂与试剂盒
            2.2.1.4 抗体
        2.2.2 实验方法
            2.2.2.1 细胞培养和转染
            2.2.2.2 质粒构建
            2.2.2.3 免疫共沉淀实验
            2.2.2.4 蛋白质印迹(Western blotting)
            2.2.2.5 慢病毒感染及稳定细胞株筛选
            2.2.2.6 细胞计数法
            2.2.2.7 细胞增殖测定(MTT实验)
            2.2.2.8 克隆形成实验
            2.2.2.9 细胞划痕实验
            2.2.2.10 Trans Well法检测细胞侵袭能力
            2.2.2.11 裸鼠皮下成瘤实验
            2.2.2.12 RNA抽提、反转录及荧光定量PCR实验
            2.2.2.13 药物敏感性实验
            2.2.2.14 免疫荧光染色
            2.2.2.15 原核融合蛋GST-p53的获得
            2.2.2.16 细胞凋亡分析
            2.2.2.17 核质分离
            2.2.2.18 统计学分析应用
    2.3 结果
        2.3.1 干扰CCDC106 可稳定p53,并抑制具有wtp53 的癌细胞的生长、迁移和侵袭
        2.3.2 蛋白激酶CK2 磷酸化CCDC106
        2.3.3 CCDC106在S130和S147 位点的磷酸化是与p53 相互作用和CCDC106定位所必需的
        2.3.4 抑制CCDC106的磷酸化可减弱其对p53蛋白的降解
        2.3.5 抑制CCDC106 磷酸化可以抑制CCDC106 的促癌功能
        2.3.6 CCDC106 增加具有wtp53 的癌细胞对CX-4945 的耐药性
    2.4 结论
第三章 ZCCHC10在肺癌中的作用及分子机制
    3.1 前言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验材料
            3.2.1.1 细胞株和菌株
            3.2.1.2 肺癌临床样本
            3.2.1.3 化学试剂和抗体
        3.2.2 实验方法
            3.2.2.1 生物信息学分析
            3.2.2.2 质粒构建
            3.2.2.3 慢病毒感染和稳定细胞株构建
            3.2.2.4 细胞培养和转染
            3.2.2.5 免疫共沉淀实验
            3.2.2.6 蛋白质印迹(Western blotting)
            3.2.2.7 细胞计数法
            3.2.2.8 细胞增殖测定(MTT实验)
            3.2.2.9 克隆形成实验
            3.2.2.10 细胞划痕实验
            3.2.2.11 Trans Well法检测细胞侵袭能力
            3.2.2.12 裸鼠皮下成瘤实验
            3.2.2.13 RNA抽提、反转录及荧光定量PCR实验
            3.2.2.14 药物敏感性实验
            3.2.2.15 免疫荧光染色
            3.2.2.16 细胞凋亡分析
            3.2.2.17 细胞周期分析
            3.2.2.18 裸鼠肿瘤转移实验
            3.2.2.20 组织切片制作以及苏木精、伊红染色
            3.2.2.21 免疫组化实验
            3.2.2.22 荧光素酶报告基因实验
            3.2.2.23 泛素化分析
            3.2.2.24 统计学分析
    3.3 结果
        3.3.1 ZCCHC10在LUAD中表达下调
        3.3.2 ZCCHC10 抑制含有wtp53 的肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭
        3.3.3 ZCCHC10在异种移植小鼠模型中抑制肿瘤生长和转移
        3.3.4 ZCCHC10 通过诱导p53 增强肺癌细胞对顺铂的敏感性
        3.3.5 ZCCHC10与p53 相互作用并稳定p53
        3.3.6 ZCCHC10 通过阻断MDM2与p53 的相互作用来抑制MDM2介导的p53泛素化
        3.3.7 ZCCHC10 通过促进p53 的抑癌功能发挥作用
    3.4 讨论
第四章 全文结论和研究展望
    4.1 全文结论
    4.2 研究展望
参考文献
中英文缩写表
攻读学位期间科研成果
致谢



本文编号：3814726