TRAF6介导的ASK1泛素化修饰在非酒精性脂肪肝炎中的分子机制研究

发布时间：2023-08-01 19:45

　　在过去的几十年内,由于生活方式的巨大变化,非酒精性脂肪肝炎(NASH)已成为目前全球最为常见的慢性肝脏疾病。NASH正迅速成为肝脏移植以及肝癌(HCC)的重要诱因,也是心血管疾病(CVDs)的高危因素。NASH发病率的急剧持续增长给个人及社会都造成巨大的经济负担。由于缺乏有效的药物治疗,NASH造成的社会负担将会继续攀升,迫切需要在分子机制和药物研发方面开展研究。在所有NASH患者中,不同个体的致病因素因其所处地域或种族的不同存在很大差异,NASH发生发展期间的复杂机制无疑给研发NASH有效治疗手段带来了巨大挑战。凋亡信号调节激酶1(ASK1)是丝裂原活化蛋白3激酶家族的成员,它是NASH发生中一个重要的激活因子。在代谢应激下,ASK1的持续性激活能够通过JNK1/2-p38信号通路促进肝脏炎症和纤维化进展。因此,抑制ASK1的活化已成为NASH治疗药物开发的主要靶点。多年研究发现,ASK1抑制剂GS4997可以通过非选择性抑制ASK1磷酸化激活对NASH发挥治疗作用,然而其III期临床治疗效果并不理想。我们推断,在保持其正常功能情况下,ASK1活性的最优调控有望成为NASH治疗的靶点...

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【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩写符号
第一章 前言
    1 非酒精性脂肪肝研究进展
        1.1 流行病学
        1.2 发病机制
            1.2.1 脂肪酸的合成与降解
            1.2.2 胰岛素抵抗(IR)
            1.2.3 氧化应激
            1.2.4 代谢综合征
            1.2.5 纤维化
                1.2.5.1 肝脏纤维化的机制
                1.2.5.2 肝细胞对HSCs活化的调控作用
            1.2.6 微生物
        1.3 NASH治疗方案及临床研究进展
            1.3.1 代谢靶点相关药物
                1.3.1.1 法尼酯 X 受体(FXR)激动剂
                1.3.1.2 过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动剂
                1.3.1.3 FGF19和FGF21 类似物
                1.3.1.4 乙酰辅酶 A 羧化酶(ACC)抑制剂和硬脂酰辅酶 A 去饱和酶-1(SCD-1)抑制剂
                1.3.1.5 甲状腺激素受体-β(THR-β)激动剂
            1.3.2 细胞应激、凋亡及纤维化靶点相关药物
                1.3.2.1 泛半胱天冬酶(pan-caspase)抑制剂
                1.3.2.2 细胞凋亡信号调节激酶 1(ASK1)抑制剂
                1.3.2.3 半乳糖凝集素-3(Galectin-3)抑制剂
                1.3.2.4 赖氨酰氧化酶样 2(LOXL2)抗体
            1.3.3 CCR2和CCR5 拮抗剂
            1.3.4 联合治疗
    2 凋亡信号调节激酶 1(ASK1)
        2.1 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路
        2.2 ASK家族及分子结构
        2.3 ASK1 活性调控机制
            2.3.1 ASK1 二聚化
                2.3.1.1 Trx
                2.3.1.2 TRAF家族
                2.3.1.3ASK2
            2.3.2 翻译后修饰(PTMs)调控
                2.3.2.1 磷酸化修饰
                2.3.2.2 泛素化修饰
            2.3.3 转录调控
        2.4 应激下的ASK1
            2.4.1 氧化应激
            2.4.2 内质网(ER)应激
        2.5 ASK1 参与调控天然免疫反应
        2.6 ASK1 相关疾病
    3 TRAFS家族成员
        3.1 TRAFs分子的结构与功能
        3.2 TRAFs参与信号通路转导
            3.2.1 TRAFs与 TNF-R信号通路
            3.2.2 TRAFs与 TLR信号通路
        3.3 TRAFs与人类疾病
            3.3.1 TRAFs敲除小鼠模型
            3.3.2 TRAFs与动脉粥样硬化
            3.3.3 TRAFs与心肌肥厚
            3.3.4 TRAFs与肝脏糖代谢
            3.3.5 TRAFs与非酒精性脂肪肝炎
    4 本研究目的及意义
第二章 材料与方法
    1 主要实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 动物饲料
        1.3 细胞系
        1.4 人体肝脏组织样本
    2 仪器设备
    3 主要试剂
        3.1 抗体
        3.2 试剂盒
        3.3 试剂耗材
        3.4 溶液及缓冲液配方
    4 病毒
    5 质粒
    6 引物序列
        6.1 qPCR所用引物序列
        6.2 质粒构建所用引物序列
    7 主要实验方法
        7.1 动物实验
        7.2 组织病理学分析
            7.2.1 组织脱水包埋
            7.2.2 石蜡切片H&E染色
            7.2.3 冰冻切片油红O染色
            7.2.4 石蜡切片PSR染色
            7.2.5 石蜡切片免疫组化
            7.2.6 石蜡切片免疫荧光染色
        7.3 小鼠血清细胞因子ELISA检测
        7.4 小鼠血清肝脏脂质分析
        7.5 动物原代细胞分离
            7.5.1 小鼠原代肝细胞分离
            7.5.2 小鼠肝脏炎症细胞分离
            7.5.3 大鼠原代HSCs分离
        7.6 免疫共沉淀分析
        7.7 外源泛素化修饰检测
        7.8 体外泛素化实验
        7.9 蛋白免疫印迹
            7.9.1 蛋白样品制备
            7.9.2 SDS-PAGE电泳
            7.9.3 转膜
            7.9.4 封闭及杂交
            7.9.5 显影
        7.10 qPCR分析
            7.10.1 总mRNA提取
            7.10.2 逆转录PCR
            7.10.3 qPCR
        7.11 分子克隆-基因点突变质粒构建方法
        7.12 GST pull-down
            7.12.1 GST标签蛋白纯化
            7.12.2 Flag标签蛋白纯化
            7.12.3 Pull-down
        7.13 荧光素酶检测技术
            7.13.1 质粒转染
            7.13.2 双荧光报告基因检测
        7.14 基因特异性敲除细胞系构建-CRISPR-cas9 技术
            7.14.1 sgRNA筛选
            7.14.2 基因敲除细胞系构建
            7.14.3 敲除细胞系鉴定
        7.15 基因稳定细胞系构建
        7.16 细胞免疫荧光分析
        7.17 细胞体外迁移实验
        7.18 统计学分析
第三章 结果与分析
    1 代谢应激作用下肝细胞ASK1 对炎症及纤维化反应影响
        1.1 高度活化的ASK1 可促进肝细胞炎症反应
        1.2 ASK1 诱导的肝细胞炎症可加速HSCs活化
    2 TRAF6 通过激活ASK1 促进肝细胞炎症反应
        2.1 TRAF6 是肝细胞中ASK1 活性的关键激活因子
        2.2 TRAF6与ASK1 在肝细胞中具有相互作用
        2.3 TRAF6 通过激活ASK1-JNK1/2-p38 信号通路促进肝细胞炎症反应
    3 TRAF6 通过激活ASK1 促进HSCS活化
    4 TRAF6 通过介导ASK1-K6 泛素化修饰发挥功能
        4.1 肝细胞中TRAF6 诱导ASK1 发生K6 泛素化修饰
        4.2 肝细胞中TRAF6 通过ASK1-K6 泛素化促进ASK1 活化
        4.3 ASK1-K6 泛素化对于激活ASK1 以及HSCs活化是必需的
    5 TRAF6 影响NASH的发生发展
        5.1 NASH进展中TRAF6 在肝细胞中特异性表达上调
        5.2 TRAF6 敲低可减轻HFHC喂养诱导的小鼠肝脏炎症和纤维化
        5.3 肝脏过表达TRAF6 能够加重HFHC喂养诱导的小鼠肝脏炎症和纤维化
第四章 讨论
    1 抑制ASK1是NASH治疗的主要分子靶点
    2 TRAF6 通过激活ASK1 促进NASH发生发展
    3 TRAF6 通过介导ASK1-K6 泛素化调控NASH发生发展
    4 研究展望
参考文献
攻博期间发表的科研成果目录
致谢



本文编号：3838242