散发型拇指多指畸形的分子病因学研究
发布时间：2023-12-05 19:39
背景及目的:多指畸形是人类最常见的先天性肢体畸形之一,其特征是手指数目多于正常人。拇指多指畸形是一种最常见多指畸形,根据我国2012年中国出生缺陷防治报告统计,每年将有约3万左右的多指(趾)患儿出生,家族性多指的比例为4.8%,而散发型的占到95.2%,轴前(拇指侧)和轴后(小指侧)的多指畸形的比例分别为74.7%和25.3%。拇指在手部功能中占有重要作用,因此拇指发生多指畸形将对手部功能造成巨大影响。拇指多指畸形根据其畸形的严重程度可分为不同类型,轻者会影响手部外观,重者在影响手部外观的同时也会影响手的抓握功能。手部功能的丧失或减低会对个体在社会生活中造成巨大的影响,手部畸形的外观也会给患者及其家庭带来较大的心理负担。拇指多指畸形在胎儿阶段即可发生,由于常规的产前诊断主要以超声诊断为主,而胎儿在子宫内常呈握拳状态使得多指畸形的诊断存在难度,大多患儿的畸形是在出生后发现。多指畸形患者常在儿童早期通过外科手术治疗切除多余的手指,如果把握好手术时机,可以获得较好的重建拇指功能。目前伴随着社会的进步和发展,人们对于拇指多指畸形的治疗不仅局限于手部功能的要求,更侧重于重塑手部的精美外观,这也为...
【文章页数】：114 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
abstract
中英文缩略词对照表
第1章 绪论
1.1 多指(趾)症概述
1.2 流行病学特征
1.3 多指畸形分类
1.4 多指畸形发病原因
1.5 多指(趾)畸形相关信号通路以及GLI3 基因
1.5.1 手指发育基本细胞生物学和主要通路
1.5.2 Shh基因
1.5.3 GLI3 基因和Shh通路
1.6 外显子组测序用于鉴定多指相关突变基因
1.6.1 外显子组定义
1.6.2 外显子组测序技术
1.6.3 外显子组测序在发现多指突变中的应用
1.7 多指的诊断和治疗
1.8 小鼠胚胎成纤维细胞在发育研究中的意义
1.9 本研究设计思路
第2章 多指患者血样处理及全外显子组测序
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 临床资料
2.2.2 试剂材料
2.2.3 实验仪器
2.2.4 基因组DNA提取方法
2.2.5 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳验证
2.2.6 基因组DNA浓度测定
2.2.7 外显子组测序与数据质量控制及预处理
2.2.8 Sanger测序
2.2.9 蛋白质序列比对
2.3 实验结果与讨论
2.3.1 实验结果
2.3.2 讨论
2.4 本章小结
第3章 小鼠胚胎成纤维细胞分离和鉴定
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 试剂材料
3.2.2 实验仪器
3.2.3 实验动物
3.2.4 试剂配置
3.2.5 小鼠胚胎成纤维细胞分离与培养
3.2.6 小鼠成纤维细胞的传代与冻存
3.2.7 免疫荧光实验步骤
3.3 实验结果
3.3.1 小鼠胚胎成纤维细胞分离与培养结果
3.3.2 小鼠胚胎成纤维细胞的鉴定结果
3.4 讨论
3.5 本章小结
第4章 GLI3 基因突变在MEFs中的功能研究
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 试剂材料
4.2.2 实验仪器
4.2.3 GLI3的p.M948I点突变质粒引物设计
4.2.4 GLI3 基因定点突变
4.2.5 质粒提取
4.2.6 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物
4.2.7 琼脂糖凝胶回收
4.2.8 质粒转化
4.2.9 重组真核质粒pCMV-N-GLI3.Mut Flag的构建
4.2.10 重组真核质粒鉴定
4.2.11 重组质粒转染MEFs
4.2.12 TRIZOL法提取RNA实验
4.2.13 RNA纯度分析
4.2.14 转录组测序基本流程(RNA-Seq)
4.2.15 测序文库构建
4.3 实验结果
4.3.1 RNA质量评估
4.3.2 测序文库质量评估
4.3.3 测序数据比对和结果统计
4.3.4 基因表达定量分析(基因/转录本)
4.3.5 基因表达PCA分析
4.3.6 差异表达基因分析
4.3.7 mRNA功能Gene Ontology富集分析(G1 vs C1)
4.3.8 mRNA功能KEGG Pathway富集分析
4.4 讨论
4.5 本章小结
第5章 Cbx3 对细胞细胞增殖及侵袭能力的影响
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 试剂材料
5.2.2 实验仪器
5.2.3 试剂配置
5.2.4 Cbx3 siRNA设计
5.2.5 Cbx3 过表达质粒的构建
5.2.6 小鼠成纤维细胞的转染
5.2.7 细胞增殖实验
5.2.8 细胞侵袭实验
5.3 实验结果
5.3.1 CBX3 过表达载体构建以及双酶切鉴定
5.3.2 MEFs中过表达CBX3 后对细胞增殖的影响
5.3.3 MEFs中过表达CBX3 后对细胞侵袭的影响
5.4 讨论
5.5 本章小结
第6章 结论与展望
6.1 全文结论
6.2 论文创新点
6.3 研究展望
参考文献
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢
本文编号：3870783
【文章页数】：114 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
abstract
中英文缩略词对照表
第1章 绪论
1.1 多指(趾)症概述
1.2 流行病学特征
1.3 多指畸形分类
1.4 多指畸形发病原因
1.5 多指(趾)畸形相关信号通路以及GLI3 基因
1.5.1 手指发育基本细胞生物学和主要通路
1.5.2 Shh基因
1.5.3 GLI3 基因和Shh通路
1.6 外显子组测序用于鉴定多指相关突变基因
1.6.1 外显子组定义
1.6.2 外显子组测序技术
1.6.3 外显子组测序在发现多指突变中的应用
1.7 多指的诊断和治疗
1.8 小鼠胚胎成纤维细胞在发育研究中的意义
1.9 本研究设计思路
第2章 多指患者血样处理及全外显子组测序
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 临床资料
2.2.2 试剂材料
2.2.3 实验仪器
2.2.4 基因组DNA提取方法
2.2.5 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳验证
2.2.6 基因组DNA浓度测定
2.2.7 外显子组测序与数据质量控制及预处理
2.2.8 Sanger测序
2.2.9 蛋白质序列比对
2.3 实验结果与讨论
2.3.1 实验结果
2.3.2 讨论
2.4 本章小结
第3章 小鼠胚胎成纤维细胞分离和鉴定
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 试剂材料
3.2.2 实验仪器
3.2.3 实验动物
3.2.4 试剂配置
3.2.5 小鼠胚胎成纤维细胞分离与培养
3.2.6 小鼠成纤维细胞的传代与冻存
3.2.7 免疫荧光实验步骤
3.3 实验结果
3.3.1 小鼠胚胎成纤维细胞分离与培养结果
3.3.2 小鼠胚胎成纤维细胞的鉴定结果
3.4 讨论
3.5 本章小结
第4章 GLI3 基因突变在MEFs中的功能研究
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 试剂材料
4.2.2 实验仪器
4.2.3 GLI3的p.M948I点突变质粒引物设计
4.2.4 GLI3 基因定点突变
4.2.5 质粒提取
4.2.6 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物
4.2.7 琼脂糖凝胶回收
4.2.8 质粒转化
4.2.9 重组真核质粒pCMV-N-GLI3.Mut Flag的构建
4.2.10 重组真核质粒鉴定
4.2.11 重组质粒转染MEFs
4.2.12 TRIZOL法提取RNA实验
4.2.13 RNA纯度分析
4.2.14 转录组测序基本流程(RNA-Seq)
4.2.15 测序文库构建
4.3 实验结果
4.3.1 RNA质量评估
4.3.2 测序文库质量评估
4.3.3 测序数据比对和结果统计
4.3.4 基因表达定量分析(基因/转录本)
4.3.5 基因表达PCA分析
4.3.6 差异表达基因分析
4.3.7 mRNA功能Gene Ontology富集分析(G1 vs C1)
4.3.8 mRNA功能KEGG Pathway富集分析
4.4 讨论
4.5 本章小结
第5章 Cbx3 对细胞细胞增殖及侵袭能力的影响
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 试剂材料
5.2.2 实验仪器
5.2.3 试剂配置
5.2.4 Cbx3 siRNA设计
5.2.5 Cbx3 过表达质粒的构建
5.2.6 小鼠成纤维细胞的转染
5.2.7 细胞增殖实验
5.2.8 细胞侵袭实验
5.3 实验结果
5.3.1 CBX3 过表达载体构建以及双酶切鉴定
5.3.2 MEFs中过表达CBX3 后对细胞增殖的影响
5.3.3 MEFs中过表达CBX3 后对细胞侵袭的影响
5.4 讨论
5.5 本章小结
第6章 结论与展望
6.1 全文结论
6.2 论文创新点
6.3 研究展望
参考文献
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢
本文编号：3870783
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