脯氨酸3-羟化酶复合物的结构机制研究
发布时间：2024-03-31 06:01
胶原蛋白是人体内含量最多的蛋白质,起着维持组织和器官结构完整性的作用。它在内质网(ER)中的折叠和组装需要多种辅助蛋白的参与,如脯氨酸3-羟化酶(P3H)、脯氨酸4-羟化酶(P4H)、分子伴侣HSP47等。其中脯氨酸3-羟化酶复合物(P3H1/CRTAP/PPIB)可以特异性地羟化I型胶原α1链986位的脯氨酸,同时该复合物还具有二硫键异构酶和脯氨酰顺反异构酶的活性。大量临床研究发现该复合物中任一组分的缺失均会导致胶原蛋白的错误折叠和成骨不全症(OI)的发生。然而P3H1复合物中这三个蛋白如何相互作用并定位于内质网中的分子机制并不清楚,且该复合物特异性地3-羟基化胶原的结构生物学机制也未明确。针对这些问题,我们首先分析了三元复合物在内质网中驻留及组装的分子机制。由于构成复合物的三个蛋白中只有P3H1拥有内质网驻留信号KDEL序列,为此我们删除了位于P3H1羧基末端的该序列,并检测了其对复合物定位的影响。我们发现该信号肽的去除导致P3H1和CRTAP共分泌到胞外,而且共分泌是通过P3H1的氨基端结构域和CRTAP相互作用所介导。体外组装实验证实,共分泌的P3H1/CRTAP复合物可以和P...
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 胶原蛋白的构象与分类
1.2 胶原蛋白的折叠与组装
1.3 脯氨酸羟化酶在胶原合成过程中的作用
1.4 脯氨酸羟化酶的功能与结构
1.4.1 脯氨酸羟化酶的羟化机制
1.4.2 脯氨酸羟化酶结构研究进展
1.4.2.1 胶原蛋白脯氨酸4-羟化酶的结构研究进展
1.4.2.2 低氧诱导因子脯氨酸羟化酶的结构研究进展
1.4.2.3 植物脯氨酸羟化酶的结构研究进展
1.4.2.4 胶原脯氨酸3-羟化酶结构研究进展
1.5 成骨不全症
1.6 P3H1/CRTAP/PPIB复合物的结构与功能
1.7 本课题研究内容和意义
第二章 材料和方法
2.1 主要试剂耗材
2.2 主要实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1 基因的获取及相关克隆构建
2.3.1.1 脯氨酸3-羟化酶家族基因的获得
2.3.1.2 质粒图谱
2.3.1.3 脯氨酸3-羟化酶P3H1 复合物的质粒构建
2.3.1.4 脯氨酸3-羟化酶家族催化结构域质粒构建
2.3.1.5 质粒的基因突变
2.3.1.6 质粒的大量抽提
2.3.2 蛋白的表达及纯化
2.3.2.1 蛋白纯化基本原理
2.3.2.2 PPIB原核表达及纯化方法
2.3.2.3 脯氨酸3-羟化酶的真核表达及纯化方法
2.3.3 P3H1/CRTAP/PPIB组装的功能实验
2.3.3.1 质粒共转染及蛋白质印记法
2.3.3.2 凝胶过滤层析法
2.3.3.3 mPEG半胱氨酸修饰法
2.3.3.4 蛋白质巯基-羧基化学交联法
2.3.3.5 质谱法鉴定复合物交联片段
2.3.3.6 PPIB酶活性测定
2.3.3.7 免疫共沉淀实验
2.3.4 蛋白质结晶实验与晶体优化
2.3.4.1 蛋白晶体初筛
2.3.4.2 蛋白晶体优化
2.3.5 蛋白晶体衍射和结构解析
2.3.5.1 晶体X射线衍射
2.3.5.2 晶体结构解析
第三章 P3H1/CRTAP/PPIB三元复合物的组装
3.1 三元复合物的组装
3.1.1 P3H1的KDEL信号肽决定了P3H1和CRTAP的共定位
3.1.2 CRTAP结合在P3H1的N端
3.1.3 P3H1与CRTAP的 C末端参与PPIB的结合
3.1.4 鉴定PPIB参与P3H1/CRTAP结合的表面
3.1.5 鉴定P3H1/CRTAP中参与与PPIB结合的位点
3.1.6 P3H1/CRTAP/PPIB三元复合组装示意图
3.1.7 PPIB的病理性突变阻碍P3H1 三元复合物的形成
3.2 本章讨论
3.2.1 P3H1 复合物内质网驻留机制
3.2.2 P3H1 复合物的分子内相互作用
3.2.3 PPIB病理性突变对P3H1 复合物功能的启示
第四章 脯氨酸3-羟化酶催化功能域的结构特点
4.1 脯氨酸3-羟化酶催化功能域蛋白的制备与结晶
4.1.1 P3H1-C蛋白的制备
4.1.2 P3H1-C去糖基化与晶体生长效果改善
4.1.3 P3H2-C蛋白的制备
4.1.4 P3H2-C的的晶体生长结果
4.1.5 P3H3-C蛋白的的制备
4.1.6 P3H3-C的的晶体生长及优化
4.2 脯氨酸3-羟化酶催化功能域的结构特点
4.2.1 脯氨酸3-羟化酶催化功能域的晶体构成
4.2.2 脯氨酸3-羟化酶催化功能域的整体结构
4.2.2.1 P3H1-C与 P3H3-C的整体结构比较
4.2.2.2 P3H1-C与 P3H3-C的活性中心比较
4.3 脯氨酸3-羟化酶催化功能域与P4H结构的异同
4.3.1 脯氨酸3-羟化酶催化功能域与CrP4H,PHD2 结构的整体比较
4.3.2 脯氨酸3-羟化酶催化功能域与CrP4H,PHD2 的活性中心比较
4.3.3 脯氨酸3-羟化酶催化功能域胶原底物结合口袋预测
4.3.4 脯氨酸3-羟化酶催化功能域与胶原底物结合模型
4.4 本章讨论
第五章 全文讨论
参考文献
缩略词
附录
致谢
学术论文和科研成果
本文编号：3943557
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 胶原蛋白的构象与分类
1.2 胶原蛋白的折叠与组装
1.3 脯氨酸羟化酶在胶原合成过程中的作用
1.4 脯氨酸羟化酶的功能与结构
1.4.1 脯氨酸羟化酶的羟化机制
1.4.2 脯氨酸羟化酶结构研究进展
1.4.2.1 胶原蛋白脯氨酸4-羟化酶的结构研究进展
1.4.2.2 低氧诱导因子脯氨酸羟化酶的结构研究进展
1.4.2.3 植物脯氨酸羟化酶的结构研究进展
1.4.2.4 胶原脯氨酸3-羟化酶结构研究进展
1.5 成骨不全症
1.6 P3H1/CRTAP/PPIB复合物的结构与功能
1.7 本课题研究内容和意义
第二章 材料和方法
2.1 主要试剂耗材
2.2 主要实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1 基因的获取及相关克隆构建
2.3.1.1 脯氨酸3-羟化酶家族基因的获得
2.3.1.2 质粒图谱
2.3.1.3 脯氨酸3-羟化酶P3H1 复合物的质粒构建
2.3.1.4 脯氨酸3-羟化酶家族催化结构域质粒构建
2.3.1.5 质粒的基因突变
2.3.1.6 质粒的大量抽提
2.3.2 蛋白的表达及纯化
2.3.2.1 蛋白纯化基本原理
2.3.2.2 PPIB原核表达及纯化方法
2.3.2.3 脯氨酸3-羟化酶的真核表达及纯化方法
2.3.3 P3H1/CRTAP/PPIB组装的功能实验
2.3.3.1 质粒共转染及蛋白质印记法
2.3.3.2 凝胶过滤层析法
2.3.3.3 mPEG半胱氨酸修饰法
2.3.3.4 蛋白质巯基-羧基化学交联法
2.3.3.5 质谱法鉴定复合物交联片段
2.3.3.6 PPIB酶活性测定
2.3.3.7 免疫共沉淀实验
2.3.4 蛋白质结晶实验与晶体优化
2.3.4.1 蛋白晶体初筛
2.3.4.2 蛋白晶体优化
2.3.5 蛋白晶体衍射和结构解析
2.3.5.1 晶体X射线衍射
2.3.5.2 晶体结构解析
第三章 P3H1/CRTAP/PPIB三元复合物的组装
3.1 三元复合物的组装
3.1.1 P3H1的KDEL信号肽决定了P3H1和CRTAP的共定位
3.1.2 CRTAP结合在P3H1的N端
3.1.3 P3H1与CRTAP的 C末端参与PPIB的结合
3.1.4 鉴定PPIB参与P3H1/CRTAP结合的表面
3.1.5 鉴定P3H1/CRTAP中参与与PPIB结合的位点
3.1.6 P3H1/CRTAP/PPIB三元复合组装示意图
3.1.7 PPIB的病理性突变阻碍P3H1 三元复合物的形成
3.2 本章讨论
3.2.1 P3H1 复合物内质网驻留机制
3.2.2 P3H1 复合物的分子内相互作用
3.2.3 PPIB病理性突变对P3H1 复合物功能的启示
第四章 脯氨酸3-羟化酶催化功能域的结构特点
4.1 脯氨酸3-羟化酶催化功能域蛋白的制备与结晶
4.1.1 P3H1-C蛋白的制备
4.1.2 P3H1-C去糖基化与晶体生长效果改善
4.1.3 P3H2-C蛋白的制备
4.1.4 P3H2-C的的晶体生长结果
4.1.5 P3H3-C蛋白的的制备
4.1.6 P3H3-C的的晶体生长及优化
4.2 脯氨酸3-羟化酶催化功能域的结构特点
4.2.1 脯氨酸3-羟化酶催化功能域的晶体构成
4.2.2 脯氨酸3-羟化酶催化功能域的整体结构
4.2.2.1 P3H1-C与 P3H3-C的整体结构比较
4.2.2.2 P3H1-C与 P3H3-C的活性中心比较
4.3 脯氨酸3-羟化酶催化功能域与P4H结构的异同
4.3.1 脯氨酸3-羟化酶催化功能域与CrP4H,PHD2 结构的整体比较
4.3.2 脯氨酸3-羟化酶催化功能域与CrP4H,PHD2 的活性中心比较
4.3.3 脯氨酸3-羟化酶催化功能域胶原底物结合口袋预测
4.3.4 脯氨酸3-羟化酶催化功能域与胶原底物结合模型
4.4 本章讨论
第五章 全文讨论
参考文献
缩略词
附录
致谢
学术论文和科研成果
本文编号：3943557
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