缺氧肝癌细胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子机制的研究

发布时间：2017-05-28 17:12

  本文关键词：缺氧肝癌细胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。肝细胞癌主要由慢性肝脏损伤引起的肝硬化发展而来,肝脏纤维化对血管具有破坏作用,肿瘤细胞迅速增殖消耗大量氧气,形成了肝癌局部的缺氧微环境。缺氧是肝细胞癌的主要特征之一,对于肝细胞癌的发生发展起着重要的调控作用。HIF-1是细胞缺氧应答的主要反应因子,由氧分压依赖的HIF-1α和非氧分压依赖的HIF-1β组成。缺氧条件下,稳定化的HIF-1α转运到核内并与HIF-1β结合形成异二聚体,该异二聚体通过结合到缺氧反应基因的启动子,促进缺氧反应基因的转录,参与调控肝癌的血管生成、侵袭转移和化放疗抵抗等行为。缺氧也会激活细胞内的NF-κB信号通路。NF-κB是由不同的亚基p65(RelA)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p105/p50)、NF-κB2(p100/p52)组成的一系列的二聚体转录因子,在调节细胞生存和免疫反应中发挥重要的作用。已有研究发现肝癌细胞中活化的NF-κB促进了炎性细胞因子(如IL-6、IL-1β)的表达,从而形成促癌的炎症微环境,参与肝癌的发生和发展。HIF-1和NF-κB的相互作用可能在维持细胞的缺氧应答中起着重要作用。以往的文献报道,NF-κB亚基p50和p65可以促进HIF-1α的转录;而HIF-1α也参与调节NF-κB的活化。但是,上述报道并没有全面地、动态地研究缺氧过程中HIF-1和NF-κB的相互作用。更好地了解缺氧肝癌细胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子机制,可能为肝癌的防治提供新的思路和策略。目的:研究缺氧条件下肝癌细胞中HIF-1和NF-κB的相互作用,并且阐明其中的分子机制。材料与方法:1、人肝癌细胞株Hep G2和Huh7经体外缺氧(1%O2)处理0-24h,qPCR和Western Blot检测HIF-1亚基HIF-1α、HIF-1β和NF-κB亚基p50、p65、c-Rel的表达2、vista软件预测hif-1α启动子是否存在p50、p65、c-rel亚基的结合位点,并且经染色质免疫共沉淀实验(chip)在hepg2和huh7细胞中验证。分别使用shnc、shp65、shc-rel慢病毒和mock、p65、c-rel过表达慢病毒转染hepg2细胞,转染的细胞经缺氧处理4h和24h,qpcr和westernblot检测hif-1α的表达。3、targetscan6.2预测hif1a3’-utr上游的mirna,mirgen2.0预测c-rel下游mirna,重叠预测结果得到候选mirna。qpcr检测缺氧肝癌细胞中候选mirna的时序表达。转染shnc、shc-rel的hepg2细胞经缺氧处理0h、4h、24h,qpcr检测候选mirna的表达。过表达候选mirna的细胞株经缺氧处理4h,qpcr、westernblot检测hif-1α的表达。荧光素酶实验验证候选mirna与hif1a3’utr结合能力。4、westernblot检测缺氧肝癌细胞中mirna合成酶dicer1的表达,使用shnc、shdicer1慢病毒转染hepg2细胞,转染的细胞经缺氧处理0h、4h、24h,qpcr检测mir-93和mir-199a-5p的表达。5、转染shnc和shdicer1的hepg2细胞经缺氧处理0h、4h、24h,qpcr和westernblot检测hif-1α的表达。6、vista软件预测dicer1的启动子是否存在hif-1、p50、p65和c-rel的结合位点,并且经染色质免疫共沉淀实验(chip)在hepg2和huh7细胞中验证;vista软件预测p50、p65、c-rel启动子是否存在hif-1的结合位点。使用shnc和shhif1a慢病毒转染hepg2细胞,转染的细胞经缺氧处理0h、4h、24h,qpcr检测p50、p65、c-rel和dicer1、mir-93、mir-199a-5p的mrna表达,westernblot检测p50、p65、c-rel和dicer1的蛋白表达。结果:1、肝癌细胞中nf-κb亚基p50、p65、c-rel的mrna和蛋白水平随着缺氧时间延长而升高(0-24h);hif-1α的mrna水平随着缺氧时间延长而升高,蛋白水平在短期缺氧时(0-4h)升高而持续缺氧时(4-24h)降低。(1)hepg2和huh7细胞中hif-1亚基hif-1α和nf-κb亚基p50、p65、c-rel的mrna水平随缺氧时间(0-24h)的延长而增加,而hif-1亚基hif-1β的mrna水平则基本不变。(2)hepg2和huh7细胞中p50、p65、c-rel的蛋白水平随缺氧时间的延长而增加(0-24h),hif-1β的蛋白水平基本保持不变,而hif-1α的蛋白水平在短期缺氧时(0-4h)增加,在持续缺氧时(4-24h)降低。2、nf-κb亚基p50和p65与hif-1α的启动子直接结合并促进hif-1α的表达;而持续缺氧时(4-24h)c-rel间接地抑制hif-1α的表达。(1)hif1a启动子上没有c-rel的结合位点,但是有p50和p65的结合位点,其中s1(chr14:62162387-62162397,序列:aggggtttccc)是p50和p65共有的结合位点,而s2(chr14:62162718-62162728,序列:ccgggctcccc)是p65独有的结合位点。(2)缺氧4h的hepg2细胞中,p65下调引起hif-1α的mrna和蛋白水平下降,而c-rel下调对hif-1α的mrna和蛋白水平无影响;缺氧24h的hepg2细胞中,p65下调导致hif-1α的mrna和蛋白水平下降,而c-rel下调对hif-1α的mrna水平无影响,却引起hif-1α的蛋白水平增加。(3)缺氧4h和24h的hepg2细胞中,p65过表达引起hif-1α的mrna和蛋白水平升高,而c-rel过表达引起hif-1α的mrna和蛋白水平降低。3、nf-κb亚基c-rel下游的mir-199a-5p和mir-93直接结合3’utr抑制hif-1α的表达。(1)hif1a3’-utr上游和c-rel下游的重叠的6个候选mirna为:mir-199a-5p,mir-18a,mir-20a,mir-93,mir-17和mir-106b。hepg2细胞中mir-17的表达水平随着缺氧时间延长而稳定升高,mir-199a-5p、mir-93和mir-106b的表达在短期缺氧时(0-4h)减少,而在持续缺氧时(4-24h)增加。mir-20a的表达在缺氧0-2h减少,在缺氧3-24h增加。mir-18a的表达在缺氧2-8h和24h减少,但是在缺氧12h增加。(2)常氧、缺氧4h、缺氧24h的hepg2细胞中,下调c-rel引起mir-199a-5p、mir-18a、mir-20a、mir-93、mir-17的表达下降,对mir-106b的表达无影响。(3)缺氧4h的hepg2细胞中,mir-93、mir-199a-5p过表达显著减少了hif-1α的mrna和蛋白表达,mir-18a过表达减少了hif-1α的蛋白表达但不影响hif-1α的mrna表达,过表达mir-17对hif-1α的mrna和蛋白水平无影响。(4)mir-93、mir-199a-5p可显著减少hif1a3’utr的荧光素酶活性,而mir-18a、mir-17对hif1a3’utr的荧光素酶活性没有影响。4、肝癌细胞中mirna合成酶dicer1的表达在短期缺氧时(0-4h)下降,而在持续缺氧时(4-24h)上升;dicer1正向调节mir-93和mir-199a-5p的表达。(1)hepg2细胞中dicer1的蛋白水平在短期缺氧时(0-4h)下降,而在持续缺氧时(4-24h)显著升高。(2)常氧和缺氧24h的hepg2细胞中,dicer1下调引起mir-93和mir-199a-5p的表达显著下降。5、Dicer1负向调节HIF-1α的表达,且该调节机制主要在持续缺氧时(4-24h)起作用。缺氧0h和4h的Hep G2细胞中,Dicer1下调对HIF-1α的mRNA和蛋白水平无影响;缺氧24h的Hep G2细胞中,Dicer1下调引起HIF-1α的mRNA和蛋白水平显著升高。6、缺氧肝癌细胞中HIF-1结合到p50、p65、c-Rel和Dicer1的启动子促进其表达,进而引起miR-93和miR-199a-5p表达上调。(1)Dicer1的启动子上不存在p50、p65、c-Rel结合位点,但是存在HIF-1的结合位点,该结合位点位于Dicer1启动子的chr14:95623615-95623634(序列:CGGCGCGCGCGTCACAGCCC)位点。(2)p50、p65、c-Rel启动子上存在HIF-1结合位点,p50启动子存在的HIF-1α结合位点为Chr4:103423385-103423404(序列:GCAGAAGTGCTTGTCAGTCC),p65启动子存在的HIF-1α结合位点为Chr11:65430400-65430419(序列:CCGCCGTCGCGTCACTGCCC),c-Rel启动子上存在的HIF-1α结合位点为Chr2:61109146-61109165(序列:CAGGGTTTGCGTGCAGAATC).(3)缺氧4h和24h的HepG2细胞中,HIF-1α下调引起p50、p65、c-Rel和Dicer1、miR-93、miR-199a-5p的mRNA水平降低,同样引起p50、p65、c-Rel和Dicer1的蛋白水平显著下降。结论:1、短期缺氧时(0-4h)HIF-1的急剧增加促进了NF-κB亚基p50、p65、c-Rel和mi RNA合成酶Dicer1的表达,p50和p65进一步促进HIF-1α的转录。2、短期缺氧时(0-4h)上调的c-Rel和Dicer1促进下游mi R-199a-5p和mi R-93表达,mi R-199a-5p和mi R-93在持续缺氧时(4-24h)靶向结合到HIF1A的3’UTR从而在转录后水平抑制HIF-1α的表达。
【关键词】：缺氧 肝细胞肝癌 HIF-1 NF-κB Dicer1 mi RNA
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 缩略语表5-7
• Abstract7-12
• 摘要12-16
• 第一章 前言16-18
• 第二章 短期缺氧和持续缺氧的肝癌细胞中HIF-1 和NF-κB的不同表达模式18-30
• 2.1 材料与方法18-25
• 2.2 结果25-28
• 2.3 讨论28-30
• 第三章 肝癌细胞中NF-κB在短期和持续缺氧时对HIF-1α 的双向调控作用30-47
• 3.1 材料与方法30-39
• 3.2 结果39-45
• 3.3 讨论45-47
• 第四章 缺氧肝癌细胞中NF-κB亚基c-Rel下游的miRNA抑制HIF-1α 的表达47-64
• 4.1 材料与方法47-58
• 4.2 结果58-63
• 4.3 讨论63-64
• 第五章 缺氧通过下调Dicer1抑制miR-93和miR-199a-5p的表达64-74
• 5.1 材料与方法64-70
• 5.2 结果70-73
• 5.3 讨论73-74
• 第六章 Dicer1在持续缺氧过程中促进HIF-1α 降解74-82
• 6.1 材料与方法74-79
• 6.2 结果79-81
• 6.3 讨论81-82
• 第七章 缺氧条件下HIF-1 上调Dicer1和miR-93/199a-5p表达82-95
• 7.1 材料与方法82-91
• 7.2 结果91-94
• 7.3 讨论94-95
• 全文讨论95-97
• 全文结论97-98
• 参考文献98-101
• 文献综述 缺氧诱导因子-1（HIF-1）对肿瘤的调控作用及其靶向治疗101-119
• 参考文献110-119
• 研究生期间发表的文章119-120
• 致谢120

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 彭岳;赵铁建;谢海源;韦燕飞;;细胞培养实验中一些细节问题的探讨[J];中华中医药学刊;2009年06期

2 郑丽君;夏文美;童村;;HeLa细胞的培养与使用[J];医药工业;1983年10期

3 李少英;李月秋;朱金玲;;三种细胞生长状况的观察[J];佳木斯医学院学报;1995年06期

4 严国俊;裴燕芳;朱贞宏;吴洁颖;潘金火;;实时细胞电子分析技术的应用研究进展[J];中国药学杂志;2014年03期

5 陈必良,穆润华,马向东,王德堂,辛晓燕,郑维国,严瑞兰;特异性反义寡核苷酸对含HPV16的SiHa细胞的作用[J];第四军医大学学报;2000年03期

6 孟洪弟,戚豫,潘虹,吴希如;无线粒体DNA的ρ°206细胞的培养及其呼吸链功能损害[J];中国优生与遗传杂志;2000年03期

7 何秉燕;邓长生;邹典定;刘湘芬;易有荣;;G-CSF对洛伐他汀诱导的K562细胞内酸碱度及凋亡的影响[J];中华血液学杂志;2006年07期

8 黄静红;李德如;阎国富;;萝卜硫素对HaCaT细胞的影响研究[J];中国美容医学;2010年11期

9 章静波,叶祝三;保护正常组织和细胞——肿瘤化疗研究中的一个动向[J];国外医学参考资料(肿瘤学分册);1978年01期

10 章静波;薛新华;;细胞松弛菌素D对EC_a-109细胞的作用[J];解剖学报;1979年01期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 刘令九;赵小琳;岳立广;徐艳玲;李淑焱;侯丽娟;隋红;姜崴;谢宝生;李勇;刘兵;李海滨;;细胞工厂培养人胚肺二倍体细胞制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗[A];2011中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会论文集[C];2011年

2 宋征;;应用Bhas42细胞试验检测22个肿瘤促长基因标志物[A];2013年（第三届）中国药物毒理学年会暨药物非临床安全性评价研究论坛论文摘要[C];2013年

3 谷彬;张辉;喻泽兰;;依地福新对Jurkat细胞生长抑制机制的研究[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年

4 武冬梅;李秀娥;葛莉亚;袁星;;双酚-A对MCF-7细胞伏安行为的影响[A];第五届全国环境化学大会摘要集[C];2009年

5 李晓飞;吕超;吴小荣;韩庆玲;王杰;易宗春;;铅和铝离子对K562细胞红系分化的影响[A];全国生化/工业与卫生毒理学学术会议论文集[C];2010年

6 宋为民;郭波;;复方甘草酸苷对HaCaT细胞表达AQP3的影响[A];2011全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2011年

7 刘鲁明;钱华;陈震;林胜友;黄挺;;参麦注射液对肿瘤细胞环核甘酸的影响[A];全国中医药科研与教学改革研讨会论文集[C];2000年

8 张雪玲;糜漫天;李等松;韦娜;张乾勇;杨志祥;;Lovastatin对HL-60细胞HMG-CoA还原酶mRNA表达及细胞增殖功能的影响[A];中国营养学会特殊营养第五届学术会议论文摘要汇编[C];2002年

9 房佰俊;廖联明;杨少光;史明霞;赵春华;;胎儿骨髓源原始干细胞分离纯化及其生物学特性的初步研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

10 李晓军;朱传东;汪萍;贾丽;陈芳芳;夏欣一;陈龙邦;;人Id3基因在A549细胞中的表达及对细胞生长功能的研究[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者 吴春燕 通讯员 宁习源 吴剑鹏;人类情绪可影响干细胞生长[N];光明日报;2014年

2 冯卫东;老化干细胞可转变成年轻干细胞[N];科技日报;2012年

3 常丽君;科学家阐明核内周期运作机制[N];科技日报;2011年

4 本版编辑邋杜华斌 邰举 毛文波 顾钢 陈超 何屹 毛黎;2007年世界科技发展回顾(六)[N];科技日报;2008年

5 通讯员 李静;厦大教授发现细胞防癌“玄机”[N];厦门日报;2009年

6 永诚;美发现控制细胞生长的蛋白质[N];中国医药报;2000年

7 记者 张孟军;加找到刺激干细胞生长分子[N];科技日报;2001年

8 张田勘;干细胞研究精彩纷呈[N];中国医药报;2011年

9 邵薇/编译;T细胞的非凡能力[N];北京科技报;2003年

10 经天;控制细胞生长的蛋白质[N];中药事业报;2000年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 蒋渊;缺氧肝癌细胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子机制的研究[D];第三军医大学;2015年

2 杨小超;阳离子配体修饰的纳米金用于细胞转运和微囊自组装研究[D];重庆大学;2010年

3 叶玲玲;基于生物素诱导表达系统的HEK293细胞多基因代谢工程改造[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年

4 梁国斌;产朊假丝酵母生产谷胱甘肽过程控制与优化[D];江南大学;2008年

5 杨海虹;钙池操纵性钙内流在人肺腺癌A549细胞中的研究[D];南方医科大学;2012年

6 常玉娟;基于Nrf2/ARE通路辛开苦降方胃康宁对人胃粘膜上皮细胞SOD2、GSTP1相关调控机制的研究[D];北京中医药大学;2015年

7 杨丽君;人Fcα/μR的表达与功能的初步研究[D];中国协和医科大学;2008年

8 李曼;DRC3f及eRF3b在肝病发生发展中作用机制的初步研究[D];河北医科大学;2011年

9 王永军;凋亡/增殖平衡失调在肺癌发生中作用的研究[D];中国协和医科大学;1997年

10 徐莺莺;全反式维甲酸诱导N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V表达受阻的肝癌细胞通过内质网应激途径发生凋亡的研究[D];复旦大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 柯自立;硫酸镁对6-羟基多巴胺损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用[D];福建医科大学;2015年

2 李婷婷;细胞穿透肽VP22对抑癌蛋白PTEN体外抗肿瘤作用影响的研究[D];川北医学院;2015年

3 王静;环氧化物酶抑制剂NS-398联合奥沙利铂对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响[D];河北医科大学;2015年

4 郑禄禄;番茄红素对转染SOD1-G93A的PC12细胞线粒体的保护作用[D];河北医科大学;2015年

5 宋晨源;氯化铵对人正常肝细胞系changliver中二氢乳清酸脱氢酶表达的影响[D];郑州大学;2015年

6 张莉;白藜芦醇体外抑制肠道病毒71型的作用机制研究[D];苏州大学;2015年

7 高华武;富硒芪云抗肿瘤作用及其机制的实验研究[D];安徽中医药大学;2015年

8 宋加奎;丹参对人胃癌SGC-7901细胞化疗敏感性的影响[D];安徽中医药大学;2015年

9 许雅鑫;尼古丁对NCI-H1975和NCI-H460细胞促进增殖作用及对PI3K/Akt通路的影响研究[D];山西医科大学;2015年

10 高娜;加减驻景方含药血清对二氯化钴诱导后ARPE-19细胞表达VEGF及HIF-1α的影响[D];青海大学;2015年

  本文关键词：缺氧肝癌细胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：403096