牙髓成纤维细胞NLRP3炎症体的表达、活化及作用机制研究

发布时间：2017-05-31 22:16

  本文关键词：牙髓成纤维细胞NLRP3炎症体的表达、活化及作用机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：固有免疫系统是保护宿主免受病原体侵害的第一道屏障,可以借助种系编码的模式识别受体识别来自病原微生物的危险信号——病原体相关分子模式以及宿主自身来源的危险信号——危险相关分子模式。目前已发现的模式识别受体有四大类,包括TLRs、CLRs、RLRs以及NLRs。不同于其他模式识别受体,一部分NLRs的家族成员可以形成炎症体、调节caspase-1活性,后者影响IL-1β的成熟和分泌。NLRP3是目前研究最为深入和广泛的一种炎症体,在多种疾病的病理过程发挥非常重要的作用。本研究组前期研究结果表明,NLRP3炎症体在人牙髓成纤维细胞(Human dental pulp fibroblasts,HDPFs)中表达,并且与牙髓固有免疫以及损伤修复具有非常密切的关系。但NLRP3炎症体在牙髓成纤维细胞中的作用如何?那些因素参与NLRP3表达的调控?其激活机制又是如何?这些问题目前尚不清楚。阐明这些问题有助于加深对牙髓组织固有免疫的理解,并为寻找牙髓炎症新的治疗方法奠定基础。研究目的:1.探讨NLRP3炎症体在HDPFs中的作用及作用机制2.探讨牙HDPFs中NLRP3炎症体的激活机制3.探讨HDPFs中NLRP3的转录调节机制4.探讨HDPFs中NLRP3的转录后调节机制方法:1.用LPS和ATP刺激HDPFs,RT-PCR和western-blot检测NLRP3炎症体相关基因的表达水平,ELISA检测细胞外IL-1β浓度。通过构建sh RNA慢病毒载体分别沉默NLRP3和caspase-1,观察两种基因对HDPFs细胞分泌IL-1β的影响。2.利用荧光染料标记细胞内ROS和超氧化物,激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测ATP刺激对HDPFs中ROS水平的影响;利用ROS抑制剂阻断ROS的生成,western-blot和ELISA检测p20表达水平和IL-1β分泌水平,观察其对NLRP3炎症体活性的影响。3.利用CLI-095、Pepinh-MYD和Bay 11-7082分别抑制TLR4、My D88和NF-κB,LPS刺激HDPFs,RT-PCR和western-blot检测NLRP3、caspase-1及IL-1βm RNA表达水平,ELISA检测细胞外IL-1β浓度。4.RT-PCR检测LPS和ATP刺激时HDPFs中mi R-223和mi R-22表达水平;荧光素酶报告检测确认mi R-223和mi R-22与靶基因NLRP3的结合;转染mi RNA mimics过表达mi R-223和mi R-22,western-blot和ELISA检测NLRP3炎症体活性。结果:1.LPS刺激引起NLRP3、caspase-1和IL-1βm RNA表达水平升高;LPS和ATP共同刺激引起HDPFs释放IL-1β;沉默NLRP3和caspase-1均可抑制IL-1β的分泌,但对IL-1βm RNA表达水平无影响。2.ATP刺激诱导HDPFs产生大量ROS;ROS抑制剂可抑制ATP刺激引起的p20的表达和IL-1β分泌。3.抑制TLR4可显著抑制NLRP3、caspase-1和IL-1βm RNA表达水平,而抑制My D88和NF-κB仅可抑制NLRP3和IL-1βm RNA表达水平,对caspase-1的表达无明显影响。4.RT-PCR结果证明mi R-223和mi R-22在HDPFs中确有表达,LPS刺激导致二者表达水平下降,荧光素酶报告检测结果证实mi R-223和mi R-22均可与NLRP33’UTR结合;过表达mi R-223和mi R-22会导致NLRP3蛋白表达水平下降,IL-1β分泌减少。结论:1.NLRP3炎症体对HDPFs细胞IL-1β的分泌起关键调节作用2.ATP激活NLRP3炎症体依赖细胞内ROS的产生3.TLR4-My D88-NF-κB信号通路调节NLRP3的表达水平4.mi R-223和mi R-22可抑制NLRP3蛋白表达并降低NLRP3炎症体活性
【关键词】：固有免疫 模式识别受体 炎症体 基因沉默 活性氧簇 TLR4 MyD88依赖信号通路 miRNA
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文献回顾17-35
• 一、炎症和模式识别受体17-18
• 二、TOLL样受体家族及其信号转导通路概述18-25
• 三、NOD样受体家族和炎症体概述25-31
• 四、TLRs等信号通路对炎症体活性和IL-1β 分泌的调节31-32
• 五、MicroRNA对炎症及炎症体活性的调节32-33
• 六、牙髓成纤维细胞在牙髓固有免疫应答中的作用33-35
• 第一部分、牙髓成纤维细胞中NLRP3 炎症体的表达及其对IL-1β 分泌的影响35-63
• 实验一、LPS和ATP刺激时牙髓成纤维细胞中NLRP3 炎症体及IL-1β 表达水平的变化36-47
• 1、材料36-37
• 2、方法37-43
• 3、结果43-45
• 4、讨论45-47
• 实验二、NLRP3 和Caspase-1 shRNA慢病毒载体的构建及相应基因沉默细胞系的建立47-56
• 1、材料47-48
• 2、方法48-52
• 3、结果52-55
• 4、讨论55-56
• 实验三、NLRP3 和Caspase-1 基因沉默对HDPF分泌IL-1β 的影响56-63
• 1、材料56
• 2、方法56-58
• 3、结果58-60
• 4、讨论60-63
• 第二部分、外源性ATP刺激对HDPF中ROS水平及NLRP3 炎症体活性影响63-74
• 实验一、ATP刺激时HDPF中ROS水平变化64-69
• 1、材料64
• 2、方法64-66
• 3、结果66-67
• 4、讨论67-69
• 实验二、ROS抑制剂对ATP激活NLRP3 炎症体的影响69-74
• 1、材料69
• 2、方法69-70
• 3、结果70-72
• 4、讨论72-74
• 第三部分、TLR4、MyD88、NF-κB信号通路对HDPF中NLRP3 炎症体表达的影响74-80
• 1、材料75
• 2、方法75-76
• 3、结果76-78
• 4、讨论78-80
• 第四部分、miR223 和mi R22 对HDPF中NLRP3 炎症体表达的影响80-98
• 实验一、miR223 和miR22 在HDPF中的表达及LPS对二者表达水平的影响81-85
• 1、材料81
• 2、方法81-83
• 3、结果83-84
• 4、讨论84-85
• 实验二、体外双荧光素酶报告系统检测miR223 和miR22 对NLRP3 的调控85-91
• 1、材料85
• 2、方法85-89
• 3、结果89-90
• 4、讨论90-91
• 实验三、过表达miR223 和miR22 对HDPF中NLRP3 表达及IL-1β 分泌的调控91-98
• 1、材料91
• 2、方法91-93
• 3、结果93-95
• 4、讨论95-98
• 小结98-99
• 参考文献99-111
• 附录111-114
• 一、shRNA-GV248 重组慢病毒载体测序结果：111-113
• 二、NLRP33’ UTR及 3’ UTR MUT测序结果：113-114
• 个人简历及研究成果114-115
• 致谢115

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 梁芳;曾朝阳;李桂源;;鼻咽癌相关固有免疫分子及其潜在临床转化前景[J];转化医学杂志;2013年01期

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 张晓;IL-8及其受体在人牙髓干细胞的表达及其调控的初步研究[D];第四军医大学;2013年

2 王海婧;NLRP3/Caspase-1在牙髓组织中的表达及其与牙髓损伤修复的关系研究[D];第四军医大学;2013年

3 蒋文凯;人牙髓成纤维细胞NLRP3/Caspase-1炎症体通路机制的初步研究[D];第四军医大学;2013年

  本文关键词：牙髓成纤维细胞NLRP3炎症体的表达、活化及作用机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：410795