神经元还原稳态减轻氧化应激损伤的新机制

发布时间：2017-06-07 13:15

  本文关键词：神经元还原稳态减轻氧化应激损伤的新机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：神经元还原稳态(Neuronal Redox Homeostasis)是神经元细胞内抗氧化物和氧化物间一种相对含量。如果神经元内氧化物含量增加过多,可大量消耗抗氧化物,神经元还原稳态可被打破,继而引起神经元细胞发生氧化损伤和凋亡。因此,维持神经元还原稳态对减轻氧化应激损伤意义重大。氧化应激损伤是导致多种中枢神经系统疾病的重要原因,包括阿尔兹海默病(Alzheimer’disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和缺血性脑卒中(Ischemic Stroke)。氧化应激损伤可引起神经元细胞凋亡和小胶质细胞过度激活,继而可引起中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)功能损害。使用抗氧化剂是减轻氧化应激损伤的有效手段。我国有使用天然抗氧化剂的传统,早在公元前,中国人就有饮用绿茶(含天然抗氧化剂茶多酚)的记载。然而,遗憾的是,被认为具有较强抗氧化作用的常见抗氧化剂,如茶多酚、维生素C、维生素E和β-胡萝卜素等,其大样本多中心临床试验结果均为阴性。抗氧化损伤机制不清是其重要因素之一。研究表明,天然大麻素四氢大麻酚(Tetrahydrocannabinol,THC)和人工合成大麻素(WIN55212-2)可通过减轻氧化应激损伤,产生神经保护作用。但由于THC具有较强的成瘾性,而WIN55212-2长期使用所导致的神经精神症状,大大限制了其临床应用。Anandamide(AEA)是一种内源性大麻素,可通过激活大麻素受体产生神经保护作用,但AEA是否可减轻氧化应激造成的神经元损伤,其抗氧化损伤机制如何,目前尚不清楚。阿米福汀(Amifostine)是一种临床常用的抗放疗损伤药物,目前用于减轻X射线和化疗药物对恶性肿瘤病人正常组织的损伤。在外周组织的研究中发现,阿米福汀具有抗氧化应激损伤作用,但阿米福汀是否可通过维持神经元还原稳态发挥抗氧化作用,目前未见报道。本研究旨在通过观察AEA和阿米福汀的神经保护作用,从维持神经元细胞还原稳态角度,分别探讨其保护机制。第一部分大麻素AEA的抗氧化神经保护机制实验一寻找适宜AEA保护浓度并观察AEA对神经元CB1受体表达的影响目的:寻找适宜AEA细胞保护浓度并观察其对神经元CB1受体表达的影响。方法:我们将HT22小鼠海马神经元细胞系暴露于含H2O2的DMEM培养基,模拟氧化应激损伤。为确定AEA适宜浓度,我们将HT22细胞分为6组,分别为正常培养的对照组(Control)、200μM H2O2损伤组和不同浓度AEA(1、5、10和20μM)的保护组。孵育3 h后,根据MTT值,确定适宜AEA浓度。随后,将细胞分为5组,分别为Control组、H2O2损伤组、AEA保护组、CB1拮抗剂AM251干预组和AM251单独使用组,采用Western blot和免疫细胞化学法观察细胞CB1受体表达情况。结果:与H2O2损伤组相比,10μM和20μM的AEA可显著提高细胞活力(P0.05)。此外,AEA可显著上调HT22细胞CB1受体表达(P0.05),CB1拮抗剂AM251逆转了AEA对CB1表达的上调作用(P0.05)。结论:我们选取10μM的AEA进行后续试验,并且观察到AEA可上调HT22细胞CB1受体表达。实验二AEA通过CB1受体维持神经元还原稳态目的:探讨大麻素CB1受体在AEA维持神经元还原稳态中的作用。方法:将细胞分为5组,分别为Control组、H2O2损伤组、AEA保护组、CB1拮抗剂AM251干预组和AM251单独使用组。孵育3 h后,通过分析细胞活力、乳酸脱氢酶(Lactic Dehydrogenase,LDH)释放量、细胞形态和细胞凋亡率,评价细胞损伤程度;通过相应试剂盒检测细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(Oxidized Glutathione,GSSG)含量,评价细胞内抗氧化物和氧化物水平。随后,使用CB1-si RNA,观察其对AEA保护作用的影响。此外,我们还使用大鼠右侧中脑动脉闭塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO),通过在体动物实验,验证了AEA的神经保护作用。结果:AEA减轻了H2O2对HT22细胞的损伤,并降低了细胞凋亡,增加了细胞内抗氧化物SOD和GSH水平,降低了氧化物ROS和GSSG含量(P0.05),AEA产生的上述作用被CB1拮抗剂或CB1-si RNA显著逆转(P0.05)。AEA对脑缺血大鼠产生的脑保护作用,也被CB1拮抗剂AM251逆转(P0.05)。结论:AEA通过CB1受体,维持神经元还原稳态并发挥神经保护作用。实验三NADPH氧化酶2在AEA产生抗氧化作用中的机制目的:探索NODPH氧化酶2(Nox2)在AEA产生抗氧化应激中的作用。方法:用Western blot和Real-Time PCR检测AEA对Nox2蛋白表达和基因转录的影响。随后,将HT22细胞分为5组,分别为Control组、H2O2损伤组、AEA保护组、Nox抑制剂Apocynin干预组和Apocynin单独给药组,通过Western blot检测Nox2表达,MTT和LDH释放量评价细胞损伤水平。结果:与Control组相比,H2O2可显著上调HT22细胞Nox2蛋白表达和基因转录水平(P0.05),AEA下调了Nox2的基因表达和蛋白转录水平(P0.05),CB1拮抗剂AM251或CB1-si RNA显著逆转了AEA的上述作用(P0.05)。此外,我们发现Nox抑制剂未对AEA产生的细胞保护作用和抑制Nox2蛋白表达作用产生显著影响(P0.05)。结论:Nox2介导了AEA对HT22细胞产生的抗氧化应激作用。第二部分细胞保护剂阿米福汀维持PC12细胞还原稳态的机制目的:探索细胞保护剂阿米福汀(Amifostine,Ami)的抗氧化神经保护机制。方法:将PC12细胞暴露于含有高浓度谷氨酸(Glutamate,Glu)的培养基中,模拟神经元的氧化应激损伤。随后,将PC12细胞分为6组,分别为正常培养的Control组、Ami单独处理组、Glu损伤组、Ami保护组、超氧化物歧化酶2干扰RNA(SOD2-si RNA)干预组和乱序RNA(SC-si RNA)干预组,孵育24 h后,通过免疫细胞化学和Western blot检测细胞SOD2蛋白表达水平;采用MTT、LDH释放量、细胞形态和凋亡率,评价细胞损伤水平。与此同时,检测细胞线粒体内超氧化物、细胞内ROS、GSH和过氧化氢酶(Catalase,CAT)水平。结果:与Control组相比,谷氨酸可下调PC12细胞SOD2蛋白表达,损伤细胞,增加线粒体内超氧化物和细胞质内ROS水平,并消耗细胞内GSH和CAT(P0.05)。阿米福汀可减轻细胞损伤程度,上调SOD2表达,降低PC12细胞损伤,下调细胞线粒体超氧化物和ROS水平,增加GSH和CAT含量(P0.05)。SOD2-si RNA显著逆转了阿米福汀产生的上述细胞保护和抗氧化应激损伤作用(P0.05),而SC-si RNA未对阿米福汀产生的上述作用造成显著影响(P0.05)。结论:阿米福汀在SOD2介导下,通过维持细胞还原稳态,发挥神经保护作用。小结:大麻素AEA在CB1受体介导下,通过抑制神经元Nox2蛋白表达和维持细胞还原稳态,发挥神经保护作用。细胞保护剂阿米福汀通过上调SOD2表达,维持PC12细胞还原稳态,发挥神经保护作用。氧化应激引起的神经元还原稳态失衡,是引起CNS氧化损伤的重要原因。本研究为治疗CNS氧化应激损伤相关疾病,提供了可能的新选择,也为维持神经细胞还原稳态,提供了新机制。
【关键词】：大麻素 阿米福汀 还原稳态 Nox2 SOD2
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R614
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-11
• ABSTRACT11-17
• 前言17-19
• 文献回顾19-35
• 一、氧化应激损伤对 CNS 的危害19-23
• 二、抗氧化剂的神经保护作用研究进展23-25
• 三、内源性大麻素系统与 CNS 疾病25-28
• 四、NADPH 氧化酶在 CNS 中的作用28-33
• 五、阿米福汀的研究和使用现状33-35
• 第一部分 大麻素AEA的抗氧化神经保护机制35-73
• 实验一 寻找适宜AEA保护浓度并观察AEA对神经元CB1受体表达的影响35-45
• 1 材料36-37
• 2 方法37-40
• 3 结果40-42
• 4 讨论42-45
• 实验二 AEA通过CB1受体维持神经元还原稳态45-63
• 1 材料45-47
• 2 方法47-53
• 3 结果53-60
• 4 讨论60-63
• 实验三 NADPH氧化酶2在AEA产生抗氧化作用中的机制63-73
• 1 材料63-65
• 2 方法65-66
• 3 结果66-70
• 4 讨论70-73
• 第二部分 细胞保护剂阿米福汀维持PC12细胞还原稳态的机制73-90
• 1 材料74-76
• 2 方法76-79
• 3 结果79-87
• 4 讨论87-90
• 小结90-91
• 参考文献91-102
• 附录102-103
• 个人简历和研究成果103-105
• 致谢105

  本文关键词：神经元还原稳态减轻氧化应激损伤的新机制，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：429196