特发性低促性腺激素性性腺功能减退症致病基因筛选及IVF妊娠结局分析

发布时间：2017-06-12 06:07

  本文关键词：特发性低促性腺激素性性腺功能减退症致病基因筛选及IVF妊娠结局分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分KISS1/KISS1R基因与特发性低促性腺激素性性腺功能减退症的相关性研究背景特发性低促性腺激素性性腺功能减退症(Idiopathic hypogonadotropic hypogonadism, IHH)是一类少见的生殖内分泌疾病。发生率约为1-10例/10万人,男性发病率约为女性的4-5倍。主要临床特征是：第二性征发育延迟或缺乏,伴有异常低水平的促性腺激素和性激素。约60%的IHH患者表现为嗅觉缺失或减退,又称为Kallmann综合征；40%的IHH患者嗅觉正常,称为nlHH(IHH with nonanosmia)。男性患者的主要临床表现为：年龄18岁,血清促性腺激素水平及睾酮水平偏低[卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)3 mIU/ml、睾酮(testosterone, T)300 ng/dl],小睾丸(单侧睾丸体积12ml),伴有射精障碍或无精子症。女性患者的主要临床表现为：闭经,孕激素撤退实验阴性,雌孕激素撤退后有阴道流血,低促性腺激素水平FSH3mlU/ml、低雌激素水平[雌二醇(estradiol,E2)30pg/ml]。IHH的病因复杂,研究发现主要发病机制是促性腺激素释放激素(Gonadotropic release hormone, GnRH)功能异常或脉冲释放异常导致下丘脑垂体性腺轴功能低下。部分IHH患者呈家族聚集性,提示遗传因素在IHH发病中的重要作用,目前候选基因研究主要集中在与GnRH释放或功能相关的基因,包括KAL1、FGFR1、PROK2、PROKR2、CHD7、KISS1、KISS1R、LEP、LEPR、 TAC3、TACR3、PCSK1、GnRHR等[1]。KISS1基因编码Kisspeptin蛋白,由位于下丘脑的Kisspeptin神经元分泌。Kisspeptin直接与GnRH神经元表面的Kisspeptin受体(KISS1R)结合,促进GnRH神经元释放GnRH进入垂体门脉循环系统,进而调控垂体前叶释放卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)。羊体内注射Kisspeptin后,GnRH神经元胞体内的GnRH mRNA表达增多,脑脊液中GnRH浓度升高,血清FSH、LH水平升高。KISS1或KISS1R基因敲除小鼠表现为低促性腺激素和低性激素水平,类似人IHH临床表现,提示KISS1、KISS1R基因是IHH的候选基因。目的在170例中国IHH患者中,筛查KISS1、KISS1R基因突变,探讨KISS1、KISSIR基因与IHH发病的相关性。方法募集2008-2013年间于山东大学生殖医院就诊的170名IHH患者作为研究对象(133名男性,37名女性),同期募集94名健康男性和93例健康女性作为对照组,自外周血提取基因组DNA,应用直接测序法筛查KISS1、KISS1R基因编码区。比较基因变异在病例组和对照组间的等位基因频率和基因型频率分布,探讨基因突变与IHH发病的相关性。结果发现KISSl基因第1外显子已知SNP rs12998、第2个外显子已知SNPrs4889,二者的等位基因及基因型频率分布与对照组无显著差异。在1例IHH合并无精症男性患者中发现KISS1R基因5’UTR区的新发杂合突变(-54C→A),位于KISS1R基因的启动子区域,对照组未发现该突变。结论首次在KISSIR基因5’UTR区发现新发突变(-54C→A),其致病作用有待于进一步研究；(ISS1、KISS1R编码区变异不是中国IHH患者的常见病因。第二部分TACR3基因在特发性低促性腺激素性性腺功能减退症中的作用及机制研究背景IHH病因复杂,研究显示促性腺激素释放激素(GnRH)功能异常或脉冲释放异常导致下丘脑垂体性腺轴功能低下是IHH的可能发生机制。NKB(neurokinin B) [43]、kisspeptin[35,76]和强啡肽(Dyn)是人类生殖系统发育和发挥正常功能不可缺少的神经肽,由位于漏斗核或弓状核上的KNDy神经元分泌。NKB与KNDy表面的受体NKR结合后调节kisspeptin的释放,kisspeptin与位于GnRH神经元表面的KISS1R受体结合,调节GnRH的脉冲释放。NK3R是NKB的高选择性G蛋白偶联受体,NKB与受体结合后激活细胞内PLC-IP3信号途径引起内质网的钙离子内流,从而发挥作用。NK3R蛋白由TACR3基因编码,TACR3基因变异影响NK3R与NKB的结合。NKB与NK3R结合后在不同性激素环境下可产生两种截然相反的结果：促进或抑制GnRH脉冲释放。在高雌激素环境下,NKB/NK3R促进kisspeptin释放,kisspeptin促进GnRH神经元释放GnRH;在低雌激素环境下,NKB/NK3R抑制LH脉冲释放,但具体机制尚不清楚。国外学者在IHH患者中发现TACR3基因突变,体外功能实验证实突变型TACR3蛋白(NK3R)与配体NKB或senktide结合,对细胞内信号通路的刺激作用减弱,钙离子内流减弱,改变了NK3R的受体功能,导致GnRH、促性腺激素释放异常。因此,TACR3是IHH的候选基因之目的本研究通过筛查170例中国IHH患者TACR3基因变异,发现新发突变并进行体外功能实验,探讨TACR3基因突变在IHH发病中的作用及机制。方法以2008年3月至2013年11月在山东大学生殖医院就诊的170名IHH患者作为研究对象(133名男性,37名女性),同期募集的200名健康男性和200例健康女性作为对照组,自外周血提取基因组DNA,应用直接测序法筛查TACR3编码区序列变异。使用Clustal W、Polyphen-2、SIFT、Mutation Taster进行生物信息学预测,通过质粒转染、钙成像实验及NFAT测钙实验分析突变的蛋白受体与配体senktide结合后细胞内信号通路的变化、钙离子浓度的变化,探讨新发突变的致病作用。结果发现1例IHH合并无精子症患者携带TACR3基因新发突变C.1108GT(P.A370S)。A370S位于第5外显子,在不同物种间高度保守,功能预测提示存在可能致病性。体外钙成像实验及NFAT测钙实验显示突变A370S增强了NK3R与配体的结合及细胞内信号通路,改变了NK3R的受体功能。但A370S并不影响NK3R蛋白表达。结论首次在大样本中国IHH患者中发现TACR3基因新发错义突变A370S,体外功能实验证实突变A370S增强了NK3R与配体的结合及细胞内信号通路,改变了NK3R的受体功能,提示该突变可能影响了GnRH和促性腺激素释放,导致IHH发病,具体作用机制有待进一步研究。第三部分家族性低促性腺激素性性腺功能减退症的致病基因筛查背景临床发现部分IHH患者呈家族聚集性,利用家系成员的遗传背景相似性,通过显性或隐性遗传方式分析,比较患者与非患者的基因序列差异,有助于发现致病基因。本部分研究对一个罕见的家族性IHH开展了全外显子组测序,筛选候选基因。该家系共有4名IHH女性患者,先证者是一位28岁不孕女性,表现为原发闭经、低促性腺激素和低性激素水平。她的3位同胞姐姐具有相同的症状,确诊为IHH。而其他2位姐姐及2位兄弟具有正常的性激素及促性腺激素水平,均已正常生育。我们采集了先证者及其母亲、兄弟姐妹的血样及相关的临床资料,借助全外显子组技术进行了候选基因的初步筛选。目的利用全外显子组测序技术,筛查家族性IHH的致病基因,并阐明作用机制。方法绘制系谱图,同期募集的200名健康男性和200例健康女性作为正常对照。将家系中的4位IHH患者及其母亲的基因组DNA进行全基因组外显子测序,测序使用Hiseq2000平台进行,测序长度2x100bp,利用truseq enrichment 68m捕获芯片进行人外显子捕获,每个样品测序不低于30M读数(6G bp)的原始数据量,获得样品的外显子测序数据。将测序结果进行生物信息学分析,按照常染色显性遗传方式筛选候选基因,符合遗传规律的新发突变位点在家系其他成员及对照组中进行直接测序。4位IHH患者中共有而其他正常家系成员及对照中未出现的突变位点视为候选基因变异,进一步探讨其与IHH发病的相关性。结果全外显子组测序及后续的验证结果显示ADHFE1基因杂合错义突变c.37AG(T13A)是唯一符合遗传规律且在对照组未出现的新发突变位点,在家系中以常染色体显性溃传方式存在。该位点在物种间相对保守,且Mutation Taster预测该位点可能致病。ADHFE1基因与IHH相关性尚未见研究报道。结论首次借助全外显子组测序技术在IHH家系中发现新的候选基因突变：ADHFE1基因杂合错义突变c.37AG(T13A),首次将ADHFE1基因与IHH联系起来。ADHFE1是否为IHH的致病基因及作用机制尚需进一步研究。第四部分特发性低促性腺激素性性腺功能减退症女性行IVF-ET助孕的妊娠结局分析目的分析特发性低促性腺激素性性腺功能减退症(idiopathic hypogonadotropic hypogonadism, IHH)女性接受体外受精一胚胎移植(IVF-ET)助孕后的妊娠结局。方法回顾性分析23例IHH患者在我院行IVF-ET助孕的卵巢反应情况及妊娠结局,以同期196例单纯输卵管性不孕接受IVF长方案助孕的女性为对照。IHH患者纳入标准：原发性闭经、基础血FSH3 IU/L、孕激素撤退试验阴性、有雌孕激素撤退出血、染色体检查正常、颅脑影像学检查无异常,反复促排卵指导同房未孕或合并输卵管性不孕；单纯输卵管性不孕纳入标准：双侧输卵管梗阻且排除输卵管积水,不合并其他不孕因素。主要分析指标：年龄,Gn总量、Gn天数、HCG日血E2水平、HCG日14mm卵泡数、HCG日子宫内膜厚度、获卵数、2PN数、第3天优胚数、妊娠率、临床妊娠率及活产率。采用t检验和×2检验。结果第一周期IVF结果显示,两组年龄分布匹配(30.48±3.82 vs 31.28±4.14岁,p0.05)。与对照组相比,病例组Gn总量显著增多(5081.52±2372.14 vs2045.21±707.33,p0.01),超促排卵Gn天数延长(13.91±1.70 vs11.08±1.70,p0.01)。HCG日血E2水平(ng/d1)(3593.70±2331.30 vs4369.37±2288.49)、HCG日大卵泡数(9.96±3.31 vsll.31±4.57)、HCG日子宫内膜厚度(cm)(1.12±0.15 vs1.09±0.18)、获卵数(13.17±7.42vs13.48±5.62)、2PN数(8.09±5.12 vs 8.72±4.50)、D3优胚数(4.48±2.92vs 4.58±2.65)均无显著差异(p0.05)。在第一周期鲜胚移植的妊娠结局方面,IHH组妊娠率为60.87%(14/23),高于对照组50.51%(99/196)；IHH组临床妊娠率为56.52%(13/23),高于对照组45.91%(90/196),但差异无统计学意义。IHH组的活产率略高于对照组[84.62%(11/13)vs 81.11%(73/90)],差异无统计学意义(p0.05)。截至2015年3月,23位IHH女性累积妊娠率为100%,流产率为13.04%(3/23)。结论相对于单纯输卵管因素不孕女性,IHH患者需要使用更多的Gn量和更长时间的超促排卵周期,但两组的获卵数、临床妊娠率、活产率及流产率均无显著差异。因此,合并其他不孕因素的IHH女性接受IVF-ET助孕后可获得理想的妊娠结局。
【关键词】：特发性低促性腺激素性性腺功能减退症(IHH) KISS1 KISS1R SNP 基因突变 IHH TACR3 基因突变 IHH ADHFE1 全基因组外显子测序 基因突变 家族性 特发性低促性腺激素性性腺功能减退症 体外受精-胚胎移植 卵巢反应 妊娠结局
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.8
【目录】：

• 中文摘要8-17
• ABSTRACT17-26
• 符号说明26-27
• 第一章、研究背景27-41
• 1.1 特发性低促性腺激素性性腺功能减退症相关基因研究进展27-33
• 1.1.1 与GnRH神经元迁移有关的基因28-30
• 1.1.2 与GnRH分泌调节有关的基因30-32
• 1.1.3 GnRHR基因32-33
• 1.2 KISSI/KISS1R与生殖33-36
• 1.3 KNDy神经元与GnRH脉冲释放36-41
• 第二章 KISS1、KISS1R基因与特发性低促性腺激素性性腺功能减退症的相关性研究41-55
• 2.1 前言41-43
• 2.2 资料与方法43-50
• 2.2.1 研究对象43
• 2.2.2 临床及生化指标检测43-44
• 2.2.3 主要实验试剂和仪器44-46
• 2.2.4 KISS1/KISS1R基因突变筛查46-50
• 2.3 结果50-52
• 2.3.1 临床基本特征50-51
• 2.3.2 KISS1基因突变51-52
• 2.3.3 KISS1R基因突变52
• 2.4 讨论52-54
• 2.5 结论54-55
• 第三章 TACR3基因在低促性腺激素性性腺功能减退症中的作用及机制研究55-89
• 3.1 前言55-56
• 3.2 资料与方法56-79
• 3.2.1 研究对象56
• 3.2.2 临床及生化指标检测56-57
• 3.2.3 主要实验试剂和仪器57-61
• 3.2.4 TACR3基因突变筛查61-65
• 3.2.5 体外功能实验65-79
• 3.2.6 统计学分析79
• 3.3 结果79-85
• 3.3.1 TACR3基因突变79-81
• 3.3.2 功能预测81
• 3.3.3 细胞转染后图像81-82
• 3.3.4 Fura-2/AM检测细胞内游离钙离子浓度实验结果82-83
• 3.3.5 NFAT测钙实验结果83-85
• 3.4 讨论85-88
• 3.5 结论88-89
• 第四章 家族性低促性腺激素性性腺功能减退症的致病基因筛查89-96
• 4.1 前言89
• 4.2 资料与方法89-91
• 4.2.1 研究对象89-90
• 4.2.2 临床及生化指标检测90
• 4.2.3 系谱图的绘制90
• 4.2.4 全基因组外显子测序及结果的验证90-91
• 4.3 结果91-94
• 4.3.1 系谱图91-93
• 4.3.2 测序结果93
• 4.3.3 功能预测93-94
• 4.4 讨论94-95
• 4.5 结论95-96
• 第五章 特发性低促性腺激素性性腺功能减退症女性行IVF-ET助孕的妊娠结局分析96-103
• 5.1 前言96
• 5.2 材料和方法96-98
• 5.2.1 病例选择与分组96-97
• 5.2.2 超促排卵方案97-98
• 5.2.3 扳机及黄体支持治疗98
• 5.2.4 统计分析98
• 5.3 结果98-100
• 5.4 讨论100-102
• 5.5 结论102-103
• 参考文献103-126
• 致谢126-127
• 攻读博士学位期间发表和待发表的学术论文127-128
• 学位论文评阅及答辩情况表128-129
• 英文论文一129-140
• 英文论文二140-149

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本文编号：443403