RPS15A通过AKT调控细胞周期促进胶质母细胞瘤细胞增殖、迁移的体内和体外研究

发布时间：2017-06-16 02:07

  本文关键词：RPS15A通过AKT调控细胞周期促进胶质母细胞瘤细胞增殖、迁移的体内和体外研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：本实验旨在探究RPS15A基因与胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移及成瘤有无相关性,以及与相关信号通路和细胞周期调节蛋白作用的分子机制,为胶质母细胞瘤的诊断和预后提供一个新的生物学标志物并为胶质母细胞瘤的基因靶向治疗提供新思路。方法：采集胶质母细胞瘤的临床肿瘤组织样本,通过实时定量PCR和Western Blot实验检测RPS15A在肿瘤组织和正常脑组织中的表达差异,用免疫组化实验检测RPS15A在肿瘤样本中的表达量;在体外实验中,我们选用人胶质母细胞瘤细胞U87作为实验细胞,通过慢病毒感染U87细胞建立shRPS15A基因低表达细胞株,用实时定量PCR及Western blot实验证明慢病毒介导稳转细胞株的成功建立；采用MTT实验检测PLV-Ctr细胞和敲低RPS15A基因后U87细胞的细胞存活率；用流式细胞仪检测PLV-Ctr细胞和敲低RPS15A基因后U87细胞的细胞周期,从而观察RPS15A基因对胶质母细胞瘤细胞U87的细胞周期的影响;通过细胞划痕实验观察RPS15A基因对胶质母细胞瘤细胞U87迁移情况的影响；通过Boyden小室实验检测PLV-Ctr细胞和敲低RPS15A基因后U87细胞中细胞运动情况从而明确RPS15A基因对胶质母细胞瘤细胞U87迁移的影响;在体内试验中,通过建立裸鼠种植瘤模型,我们观测了RPS15A基因对胶质母细胞瘤U87细胞裸鼠种植瘤成瘤时间和大小的影响,通过免疫组化实验检测RPS15A基因在裸鼠种植瘤的肿瘤组织中的表达情况,进而从病理和组织学的角度考察RPS15A基因对胶质母细胞瘤U87细胞的体内成瘤的作用;我们还通过Western blot检测RPS15A基因对细胞周期蛋白P18INK4C和CDK4及磷酸化AKT的表达的影响以证实在RPS15A基因与AKT信号通路的关联,并通过AKT信号通路的的介导调控周期蛋白,明确RPS15A基因在胶质母细胞瘤中的作用靶点。结果：在本研究中,我们通过Q-rtPCR和VWestern blot实验检测胶质母细胞瘤临床样本中RPS15A基因的表达,结果表明相比于正常脑组织,胶质母细胞瘤中RPS15A基因的mRNA及蛋白表达增高。同样的,我们通过免疫组化检测RPS15A基因在临床肿瘤样本中的表达情况,并分别从年龄、性别、组织分型及世界卫生组织的分期评价RPS15A基因的表达情况,结果发现当患者年龄大于50岁时,高表达RPS15A基因的例数为43例,占样本数的71.7%,低表达RPS15A基因的例数为17例,占样本数的28.3%；而患者年龄小于50岁时,高表达RPS15A基因的例数为47例,占样本数的74.6%,低表达RPS15A基因的例数为16例,占样本数的25.4%；在男性患者中,高表达RPS15A基因的例数为32例,占样本数的64%,低表达RPS15A基因的例数为18例,占样本数的36%；在女性患者中,高表达RPS15A基因的例数为58例,占样本数的79.5%,低表达RPS15A基因的例数为15例,占样本数的20.5%;在相关的组织学类型的调查中显示,在星形细胞胶质瘤中,高表达RPS15A基因的例数为9例,占样本数的64.3%,低表达RPS15A基因的例数为5例,占样本数的35.7%;在少突神经胶质瘤中,高表达RPS15A基因的例数为6例,占样本数的66.7%,低表达RPS15A基因的例数为3例,占样本数的33.3%；在间变星型细胞瘤中,高表达RPS15A基因的例数为47例,占样本数的78.3%,低表达RPS15A基因的例数为13例,占样本数的21.7%；在胶质母细胞瘤中,高表达RPS15A基因的例数为30例,占样本数的75%,低表达RPS15A基因的例数为10例,占样本数的25%；在WHO分期为Ⅰ和Ⅱ期的胶质细胞瘤中,高表达RPS15A基因的例数为8例,占样本数的34.8%,低表达RPS15A基因的例数为15例,占样本数的65.2%;在WHO分期为Ⅲ和Ⅳ期的胶质母细胞瘤中,高表达RPS15A基因的例数为84例,占样本数的84%,低表达RPS15A基因的例数为16例,占样本数的16%。综上所述,与正常脑组织对比,RPS15A基因的表达量在胶质母细胞瘤中明显增高,并且通过临床病例的统计发现,在WHO分期Ⅲ和Ⅳ期的胶质细胞瘤中,RPS15A基因的表达显著增高,说明在恶性胶质瘤的发展过程中,RPS15A基因可能扮演着重要的作用。另外,我们发现胶质瘤患者的临床病理特征和患者预后情况与RPS15A基因之间的可能存在相关性,高表达RPS15A基因的患者的预后相比于低表达RPS15A基因的患者的预后更差,这更加证明了RPS15A基因可以作为判断患者预后的生物标志物之一。体外实验中,我们首先在U87细胞中建立了由慢病毒介导的sh-RPS15A基因敲低细胞模型,并通过实时定量PCR证明了sh-RPS15A基因敲低细胞模型建立成功；我们通过MTT实验检测细胞的存活率,与PLV-Ctr细胞相比,敲低RPS15A基因的U87细胞的存活率明显增高。我们通过细胞流式技术对细胞周期和细胞的增殖情况进行检测,结果显示与PLV-CTR组相比,敲低RPS15A基因的U87细胞的细胞周期发生变化,主要表现为G0/G1期阻滞；在细胞划痕实验中,我们发现与PLV-Ctr细胞相比,敲低RPS15A基因的U87细胞的迁移速度和数量明显下降；在Boyden小室实验中,我们同样发现与PLV-Ctr细胞相比,敲低RPS15A基因后U87细胞的迁移速度和数量明显下降；体内实验表明,与PLV-Ctr细胞相比,敲低RPS15A基因的U87细胞呈现明显的细胞增殖抑制,裸鼠荷瘤的体积显著减小,RPS15A基因表达降低可以显著减缓肿瘤的成瘤进程；在对机制的探讨方面,主要对细胞周期蛋白和AKT信号通路进行了检测,结果发现与PLV-Ctr细胞相比,敲低RPS15A基因的U87细胞中P18INK4C表达增加,而CDK4的表达的明显减少；与PLV-Ctr细胞相比,敲低RPS15A基因的U87细胞中磷酸化AKT的表达减少,进而说明RPS15A通过对磷酸化AKT的调控影响U87细胞的体内及体外增殖。结论：RPS15A基因在胶质母细胞瘤临床样本中表达显著上调,RPS15A基因可能存在靶基因AKT,即AKT信号通路可能与RPS15A基因在胶质母细胞瘤中的癌基因作用相关,下调RPS15A基因的表达可以抑制磷酸化AKT的活性,抑制U87细胞体外增殖、迁移以及体内成瘤,AKT可能是RPS15A基因的作用靶点,我们的研究结果为胶质母细胞瘤的诊断和预后提供了新的生物学标志物,并为胶质母细胞瘤的基因靶向治疗提供了新依据。
【关键词】：胶质母细胞瘤 RPS15A AKT
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.4
【目录】：

• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-17
• 引言17-20
• 材料与方法20-45
• 1. 材料20-27
• 1.1 药品与试剂20-21
• 1.2 仪器21-23
• 1.3 临床病例、动物和细胞23
• 1.4 主要溶液的配制23-27
• 2. 实验方法27-45
• 2.1 细胞培养27-28
• 2.2 病毒感染目的细胞28-34
• 2.3 细胞增殖实验34
• 2.4 细胞周期实验34-35
• 2.5 细胞划痕实验35-36
• 2.6 细胞迁移实验36
• 2.7 裸鼠移植模型建立36-37
• 2.8 肿瘤组织病理学检测37-38
• 2.9 病理免疫组化38-39
• 2.10 QRT-PCR实验39-42
• 2.11 Western Blot实验42-45
• 2.12 数据处理45
• 结果45-56
• 1. RPS15A基因在肿瘤组织中的表达高于正常脑组织45-47
• 2. 胶质瘤患者术后生存时间与RPS15A基因表达密切相关47-50
• 3. U87细胞Sh-RPS15A稳转细胞系验证50-51
• 4. RPS15A基因对胶质母细胞瘤细胞增殖的影响51
• 5. RPS15A基因对胶质母细胞瘤细胞迁移的影响51-53
• 6. RPS15A基因对胶质母细胞瘤细胞细胞周期的影响53
• 7. RPS15A基因对胶质母细胞瘤细胞周期蛋白表达的影响53-54
• 8. RPS15A基因对磷酸化AKT表达的影响54-55
• 9. RPS15A基因对裸鼠种植瘤增殖的影响55-56
• 讨论56-60
• 结论60
• 参考文献60-72
• 综述72-90
• 参考文献83-90
• 致谢90

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本文编号：454092