先天性巨结肠肠神经系统及血清中Neuroligin基因与谷氨酸的表达和意义

发布时间：2017-06-20 00:02

  本文关键词：先天性巨结肠肠神经系统及血清中Neuroligin基因与谷氨酸的表达和意义，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：作为一种常见的消化道先天性畸形和典型的肠神经系统发育异常性疾病,先天性巨结肠(Hischsprung's disease, HD)的大体病理改变主要为病变肠段肠神经节细胞的缺如,病变肠管痉挛狭窄,病变肠段近端的结肠由于蠕动加强而代偿性肥厚扩大,最终引起巨结肠的发生。临床上以呕吐、腹胀、便秘为主要表现,可出现肠梗阻、肠穿孔以及小肠结肠炎等并发症,严重者会危及生命。虽然关于其病因研究的学说有很多,但都不能完全解释其发病机制。在常见的基因异常学说中,与HD密切相关的RET等许多基因(SOX10基因、ECE1基因等)的突变只在大约50%的家族性病例患儿和7%到35%的散发病例患儿中发现,所以这种学说无法全面地解释HD的发病机制；肠道微环境异常学说认为细胞外基质成分的过度增多,导致了肠神经嵴细胞由于过早分化、成熟、粘附、聚集而无法正常迁移达到结肠远端导致了该消化道畸形的发生,然而有研究发现尽管在HD患儿痉挛段肠管中未发现神经节细胞,但在其盆腔神经丛支配的膀胱、前列腺等脏器内却发现了正常的的神经节细胞,故仅用肠道微环境的异常解释导致肠神经嵴细胞迁移的停止而导致HD发生也是不全面的；此外还有肠道Cajal间质起搏细胞(inters titial cells of cajal, ICC)异常学说认为ICC数量的减少和网格状结构的破坏与HD关系密切,由于ICC的异常导致肠道起搏功能的障碍,使肠道慢波活动丧失,导致HD的发病。但是同时也有实验证实有些HD病例的无神经节细胞段中ICC的分布及数量与正常肠管并无太大差异。所以这种单一的理论也无法完全阐释HD的发病机理。这些学说都只是在某一方面说明一部分病人的发病机制,不能形成一套统一全面的基础理论。而由于基础理论的不确定,导致对该病的诊断、鉴别以及分型都存在一定的局限和困难。本研究拟从神经系统突触发育异常的角度,讨论已经在中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)中研究地较为深入的突触后跨膜吸附蛋白的编码基因Neuroligin基因及相应的突触后跨膜吸附蛋白Neuroligins蛋白在HD肠神经系统(Enteric Nervous System, ENS)中肌间神经丛Cajal间质细胞(inters titial cells of cajal within the myenefic region, ICC-MY)的表达情况,并进一步研究Neuroligin-1蛋白亚型及其相关的谷氨酸(Glutamate, G lu)在HD病人肠管ENS中和血液中的表达,从ENS突触功能异常的角度讨论Neuroligin基因及Glu的表达和变化与HD发病的关系,进而探讨其对HD发病机制的基础研究和临床实践的意义。方法：肠管和血液标本取自2010年至2013年间山东大学齐鲁医院小儿外科收治的90例病理诊断为HD的患儿(短段型50例,长端型40例),另取50例腹股沟斜疝患儿(indirect inguinal hernia, IIH)的血液标本作为对照。为减小研究误差,我们控制入选研究的各组患儿的年龄、基础代谢率以及营养状况(包括身长、体重、血清总蛋白、血清白蛋白、血红蛋白、血尿素氮等等)之间无统计学差异。收集HD切除肠管的狭窄段(无神经节细胞段)、移行段和扩张段近端(正常段、有神经节细胞段)。部分新鲜组织置于-80℃储存用于Vestern-blot和 qRT-PCR,进行Neuroligin-1,2,3,4 (Neuroligins)、Neuroligin-1和Glu的定量分析和比较；部分组织制备肠肌间神经丛铺片(Longitudinal muscle with adherent myenteric plexus, LMMP)用于免疫化学染色研究Neuroligins、Neuroligin-1和 Glu在ENS的表达情况和ICC-MY的分离培养；部分组织制备石蜡切片用于免疫组化染色研究Neuroligin-1的表达情况；免疫磁珠分选(Magnetic-activated Cell Sorting, MACS)和流式细胞术(flow cytometry, FCM)用于ICC-MY的分选和计数。收集HD和IIH患儿的血清,-80℃储存备用,使用ELISA技术检测各自的血清Glu含量并通过进行长段型HD、短段型HD和非HD之间的比较研究其对HD诊断、鉴别以及临床分型的重要意义。数据采用“均数±标准差”表示,两组数据组间比较采用配对t检验进行分析,三组数据之间两两比较采用单因素方差分析和Turkey's检验进行分析。使用SPSS11.5和GraphPad Prism5.0软件进行统计分析,P0.05为有统计学意义。结果：(1)对LMMP进行免疫组化染色证实ICC-MY表达于LMMP,细胞之间相互联系从而构成网格状结构,且该网格状结构在无神经节细胞段和有神经节细胞段之间并无明显差异。(2)对LMMP进行双重免疫荧光染色证实Neuroligin-1,2,3,4蛋白表达于ICC-MY,且Neuroligins蛋白在无神经节细胞段构成的网格结构不完整,说明Neuroligins蛋白在无神经节细胞段表达减少。(3)以新鲜LMMP分离培养细胞后,通过MACS纯化分选出ICC-MY,并使用FCM进行细胞计数,证实虽然分选出的ICC-MY细胞数由扩张段近端到移行段再到狭窄段逐渐减少,但三组细胞中含有的ICC-MY比例并无明显差异。(4)使用细胞免疫荧光染色对分选出的细胞进行染色,证实为梭形和纺锤形的ICC-MY。(5)以ICC-MY的特异性抗体C-kit为参考,使用Western-blot技术对来自狭窄段、移行段、扩张段近端的细胞中的Neuroligins蛋白进行分析,证实Neuroligins蛋白的表达量由扩张段近端到移行段再到狭窄段逐渐降低。(6)双重免疫荧光技术显示Neuroligin-1蛋白和Glu在LMMP表达于同一部位且在无神经细胞段的表达少于有神经节细胞段。(7)免疫组化显示,Neuroligin-1蛋白在石蜡切片的表达由扩张段近端到移行段再到狭窄段逐渐减少,Glu在LMMP的表达也由扩张段近端到移行段再到狭窄段逐渐减少。(8)Western-blot和qRT-PCR显示Neuroligin-1和Glu的表达由扩张段近端到移行段再到狭窄段逐渐减少,差异有统计学意义,与免疫化学显示结果相符。(9)ELISA检测血清Glu显示,由长段型HD到短段型HD再到非HD,血清Glu的含量逐渐增高,差异有统计学意义。结论：通过上述实验和所得到的结果我们可以得到以下结论：(1) Neuroligins蛋白表达于HD患儿ENS中的ICC-MY,其表达量由狭窄段到移行段再到扩张段近端的变化可能会导致ICC-MY突触功能的异常,突触功能的异常会进而影响ENS中神经冲动和神经信号的传递,继而导致由ICC-MY引发的肠道起搏功能受损,使得病变段的肠管丧失蠕动功能,最终导致HD的发生。(2)N euroligin-1蛋白亚型和与其密切相关的Glu在HD患儿的ENS同一部位表达,这不仅可能作为ENS中神经元,特别是兴奋性神经后突触的新的分子标记,其表达量由狭窄段到移行段再到扩张段近端的变化也可能会通过引发兴奋性突触后功能的异常进而导致肠道舒缩异常最终形成了HD的发生。(3)血清Glu含量的检测以及其在不同组别表达量的不同对HD的诊断、鉴别诊断和分型有重要的临床意义,提示我们可以在影像学检查的基础上结合血液学的实验室检测手段,进一步提高HD诊断,特别是新生儿HD诊断的准确率以及为HD的分型(长段型、短段型、常见型等)提供新的参考依据。通过我们的研究,从新的角度探究了HD的发病机制并初步探讨了对HD的诊断、鉴别诊断等有重要意义的新的实验室方法,这为HD的基础研究和临床实践提供了新的方向和科研思路。
【关键词】：先天性巨结肠 Neuroligin 肠神经系统 cajal间质细胞 谷氨酸
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R726.5
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 符号说明14-16
• 前言16-20
• 实验材料和方法20-34
• 实验结果34-40
• 讨论40-50
• 结论50-52
• 创新点及不足之处52-53
• 附表及附图53-71
• 参考文献71-79
• 致谢79-81
• 攻读学位期间发表的论文81-82
• 学位论文评阅及答辩情况82-83
• 外文论文一83-104
• 外文论文二104-126

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 陈敏,罗和生;肠神经系统神经肽对免疫系统的作用[J];国外医学(内科学分册);2005年07期

2 汪海全;刘洪涛;吴秀卿;;肠神经系统[J];长江大学学报(自科版);2006年12期

3 刘兴攀,张文同,董志行,张金哲;先天性巨结肠c-kit~+肠间质细胞分布的免疫组织化学研究[J];中华小儿外科杂志;2003年02期

  本文关键词：先天性巨结肠肠神经系统及血清中Neuroligin基因与谷氨酸的表达和意义，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：464057