H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠模型中水平传播的分子机制研究

发布时间：2017-06-27 08:24

  本文关键词：H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠模型中水平传播的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在禽类中广泛流行的H9N2亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)已经引起多例感染人的事件。血清学调查表明,我国部分禽类从业者中H9亚型AIV抗体阳性率可达2.3%~13.7%。人感染H9N2亚型AIV后表现的症状与感染季节性流感病毒相似而容易被人忽视,增加了其在人体内适应突变的机率,更重要的是部分病毒株已经具有结合人样流感病毒受体的能力。本研究中,我们选择1株H9N2亚型AIV分别在哺乳动物模型(小鼠和豚鼠)体内连续适应后评价其适应病毒株的致病力和传播能力,并初步探索影响这些改变的分子机制。已有研究表明,H5N1亚型AIV和H7N1亚型AIV能够通过在雪貂体内连续传代而获得高效的传播能力。本研究中,我们评价A/Chicken/Shandong/Li-2/2010(H9N2)(简称SD2)病毒株能否通过在豚鼠体内连续传代后获得水平传播能力。适应9代后,病毒株获得了在豚鼠中接触传播能力(2/3),15代后接触传播能力进一步增加(3/3)。利用反向遗传技术对15代病毒株进行逐一突变后,发现3个氨基酸突变(HA1-Q227P、HA2-D46E和NP-E434K)决定H9N2亚型AIV的接触传播能力(2/3)。HA蛋白的两个突变位点能增加病毒对禽样受体的结合能力。HA2-D46E能够增强病毒的热稳定性;NP-E434K能够显著增强病毒体外的聚合酶活性。除了上述3个关键位点外,我们还发现PB2-D195N对SD2病毒株的传播有一定的协同作用。SD2病毒株能够通过在豚鼠中适应而获得传播能力,为了比较宿主差异对流感病毒适应突变的影响,我们将SD2病毒株同样在小鼠体内连续传代而得到小鼠适应病毒株。5代后小鼠适应病毒株的致病力比母本病毒株提高1000倍,并且获得3个氨基酸突变(HA-N313D/N496S和PB2-E627K)。HA-N313D/N496S能够增加病毒对人样受体的结合能力,而PB2-E627K能够增强病毒的体外聚合酶活性。进一步,我们评价这株小鼠适应病毒株能否像豚鼠适应病毒株一样在豚鼠中的传播,3只接触组豚鼠的鼻洗液中都没有检测到流感病毒。结果表明SD2病毒株在小鼠体内获得的受体结合能力的增强和聚合酶活性的增加不能使其获得在豚鼠中的传播能力。聚合酶蛋白影响流感病毒的在宿主中复制及传播能力。上文中我们发现PB2-D195N协同SD2病毒株在豚鼠中的传播。通过Genbank数据库查询,我们发现PB2-195N存在于多个亚型禽流感病毒中,并且与PB2-627K共同存在于少数H5N1流感病毒中。因此,我们将这两个位点同时引入SD2病毒株中并评价其在豚鼠中的传播能力,结果发现这株突变病毒获得了在豚鼠中的接触传播能力(3/3)。不仅如此,这两个氨基酸突变同时扩大了SD2病毒株在小鼠体内的组织嗜性。我们的研究结果表明,病毒在不同哺乳动物宿主中适应后传播能力与致病能力的变化不同,宿主差异会影响病毒的进化方向。3个氨基酸的适应性突变(HA1-Q227P、HA2-D46E和NP-E434K)就可以使H9N2亚型AIV获得在豚鼠中接触传播的能力(2/3),而决定病毒致病性的PB2-627K与PB2-195N协同作用后会使病毒获得在豚鼠中的接触传播能力(3/3)。进一步的分子机制分析表明,病毒受体结合特性与聚合酶活性决定病毒的传播能力。本研究丰富对H9N2亚型流感病毒的认知,对大流行流感的预警也具有重要参考价值。
【关键词】：H9N2 AIV 豚鼠模型 水平传播 受体结合能力 聚合酶活性
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R511.7;R-332
【目录】：

• 附表3-6
• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 英文缩略表13-14
• 第一章 引言14-28
• 1.1 20世纪人类历史上5次流感病毒的大流行14-15
• 1.1.1“西班牙”H1N1流感大流行14
• 1.1.2 亚洲H2N2流感大流行14
• 1.1.3“香港”H3N2流感大流行14-15
• 1.1.4 H1N1的再次出现15
• 1.1.52009甲型H1N1流感大流行15
• 1.2 H5、H7和H9亚型AIVs在哺乳动物模型中水平传播研究进展15-17
• 1.2.1 H5N1亚型禽流感病毒15-16
• 1.2.2 H9N2亚型禽流感病毒16-17
• 1.2.3 H7N9亚型禽流感病毒17
• 1.3 流感病毒从动物到人的传播屏障17-20
• 1.3.1 野禽到人传播的障碍18-19
• 1.3.2 流感病毒跨种传播的途径19-20
• 1.3.3 传染路径的屏障20
• 1.4 病毒和细胞间相互作用的屏障20-24
• 1.4.1 病毒与宿主细胞的吸附21-22
• 1.4.2 病毒和细胞融合22-23
• 1.4.3 病毒的复制23-24
• 1.4.4 病毒的释放24
• 1.5 流感病毒在人群中适应的分子机制和进化途径24-26
• 1.5.1 病毒复制过程中的基因突变24-26
• 1.5.2 不同亚型病毒基因重组26
• 1.6 本研究的目的与意义26-28
• 第二章 H9N2 AIV在豚鼠中传播的分子机制初步研究28-47
• 2.1 材料与方法28-34
• 2.1.1 病毒株与实验动物28-29
• 2.1.2 细胞、菌株与载体29
• 2.1.3 主要试剂29
• 2.1.4 主要仪器29
• 2.1.5 病毒RNA的提取、反转录和PCR扩增29-30
• 2.1.6 PCR胶回收方法及质粒提取方法30-31
• 2.1.7 点突变方法及突变引物的设计31
• 2.1.8 流感病毒受体检测方法31-32
• 2.1.9 流感病毒聚合酶复合体活性的测定32
• 2.1.10 流感病毒HA蛋白热稳定性和酸稳定性检测32
• 2.1.11 SD2/H9N2病毒株及突变病毒株的拯救32-33
• 2.1.12 H9N2亚型AIV对小鼠致病力评估33
• 2.1.13 H9N2亚型AIV在豚鼠模型中接触传播能力的评估33
• 2.1.14 SD2豚鼠适应病毒株在豚鼠模型和雪貂模型间的气源性传播能力评估33
• 2.1.15血清抗体检测33-34
• 2.2 结果34-45
• 2.2.1 3株H9N2亚型AIVs对小鼠致病力及HA受体结合能力的评估34-35
• 2.2.2 3株H9N2亚型AIVs在豚鼠模型中接触传播能力的评估35-36
• 2.2.3 SD2病毒株通过在豚鼠体内适应性传代而获得接触传播能力36-37
• 2.2.4 SD2/H9N2豚鼠传代病毒株与母本病毒株全基因序列的比较分析37-38
• 2.2.5 影响豚鼠适应病毒株在豚鼠模型中接触传播的关键氨基酸位点的确定38-39
• 2.2.6 HA1-Q227P和HA2-D46E氨基酸突变改变病毒受体结合能力39-40
• 2.2.7 HA2-D46E增加病毒HA蛋白的热稳定性40-41
• 2.2.8 HA1-Q227P能够降低病毒HA蛋白的酸稳定性41-42
• 2.2.9 NP-E434K能增显著增加在 33℃条件下的病毒聚合酶活性42-43
• 2.2.10 P15代豚鼠适应病毒株在豚鼠模型和雪貂模型中气源传播的效率较低43-45
• 2.2.11豚鼠适应传代病毒株对小鼠致病力评估及抗原性分析45
• 2.3 讨论45-47
• 第三章 SD2小鼠适应病毒株在豚鼠模型中的传播能力评估47-58
• 3.1 材料与方法47-52
• 3.1.1 病毒株与实验动物47
• 3.1.2 细胞、菌株与载体47-48
• 3.1.3 主要试剂48
• 3.1.4 主要仪器48
• 3.1.5 病毒RNA的提取、反转录和PCR扩增48-49
• 3.1.6 PCR胶回收方法及质粒提取方法49
• 3.1.7 点突变引物的设计49-50
• 3.1.8 SD2病毒株及突变病毒株的拯救50
• 3.1.9 SD2病毒株在小鼠体内的适应性传代50
• 3.1.10 小鼠致病力评估实验50-51
• 3.1.11 SD2小鼠适应病毒株在豚鼠模型中的传播能力评估51
• 3.1.12 SD2小鼠适应病毒株受体结合能力检测51
• 3.1.13 SD2小鼠适应株病毒株体外聚合酶活性检测51-52
• 3.1.14 血清抗体的检测52
• 3.2 结果52-56
• 3.2.1 P5小鼠适应病毒株对小鼠的致病力增加52-53
• 3.2.2 P5小鼠适应病毒株对 α2,6-糖苷键SA结合能力增强53-54
• 3.2.3 PB2-E627K显著增加病毒的体外聚合酶活性54-55
• 3.2.4 P5小鼠适应病毒株不能在豚鼠模型中发生传播55-56
• 3.3 讨论56-58
• 第四章 PB2-D195N和PB2-E627K有助于SD2病毒株在豚鼠中的传播58-68
• 4.1 材料与方法58-62
• 4.1.1 病毒株与实验动物58
• 4.1.2 细胞、菌株与载体58
• 4.1.3 主要试剂58-59
• 4.1.4 主要仪器59
• 4.1.5 病毒RNA的提取、反转录和PCR扩增59-60
• 4.1.6 PCR胶回收方法及质粒提取方法60
• 4.1.7 点突变引物的设计及突变病毒株的拯救60
• 4.1.8 流感病毒聚合酶复合体活性的测定60-61
• 4.1.9 小鼠致病力评估实验61
• 4.1.10豚鼠模型间传播能力评估61
• 4.1.11血清抗体的检测61-62
• 4.2 结果62-66
• 4.2.1 PB2-D195N不能协同增强PB2-E627K对SD2病毒体外聚合酶活性62-63
• 4.2.2 PB2-D195N和PB2-E627K能够增加SD2病毒株在小鼠体内的组织嗜性63-65
• 4.2.3 PB2-D195N和PB2-E627K有助于SD2病毒株在豚鼠中发生接触传播65-66
• 4.3 讨论66-68
• 第五章 全文结论68-69
• 参考文献69-77
• 致谢77-78
• 作者简历78

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