RNA干扰CPNE1基因表达对人骨肉瘤Saos-2细胞生物学行为的影响及其机制

发布时间：2017-07-01 05:15

  本文关键词：RNA干扰CPNE1基因表达对人骨肉瘤Saos-2细胞生物学行为的影响及其机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本课题通过RNA干扰技术靶向沉默CPNE1基因,在体外细胞实验中观察沉默CPNE1基因对人骨肉瘤Saos-2细胞株生物学行为的影响并探讨其分子机制,从而为基因治疗研究提供实验依据。方法:应用免疫组化技术检测CPNE1在骨肉瘤组织中的表达情况,再针对CPNE1基因构建慢病毒干扰载体转染Saos-2细胞,以转染阴性载体的Saos-2细胞作为对照。通过在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达来确定转染效率,通过RT-PCR和荧光实时定量PCR检测得到CPNE1基因在m RNA水平表达的变化。通过Western blotting技术检测观察CPNE1基因在蛋白水平表达的变化,以明确RNAi的抑制率。应用Western blotting技术检测BIRC3、CPNE1、IRAK2和TNFSF10在蛋白水平表达的变化,采用Cellomics分析仪和流式细胞仪检测Saos-2细胞增殖、细胞周期和凋亡在CPNE1基因沉默前后的变化。由所得数据分析CPNE1基因沉默对这些蛋白表达水平以及细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。应用Affymetrix Gene Chip primeview human基因芯片检测全基因表达谱在下调人骨肉瘤Saos-2细胞CPNE1基因表达后的变化,并应用软件分析筛查数据,综合分析相关基因。结果:成功构建针对CPNE1基因的RNAi慢病毒表达载体,DNA测序鉴定和RT-PCR表明干扰片段的碱基序列与插入位点完全正确;在293T细胞中进行慢病毒包装从而获得高滴度上清液;通过重组慢病毒载体在Saos-2细胞中转导入CPNE1sh RNA,转染效率超过90%;构建的重组慢病毒LV-CPNE1在m RNA水平和蛋白水平均能抑制CPNE1基因的表达,抑制率超过80%;RNAi技术沉默CPNE1基因表达可抑制Saos-2细胞增殖,影响Saos-2细胞周期进程,发生G2/M期阻滞,促进细胞凋亡芯片研究筛选出差异表达基因400个,其中上调基因133个,下调基因267个。利用RNAi技术沉默CPNE1基因表达可下调BIRC3、IRAK2和TNFSF10的表达。结论:成功构建了CPNE1基因稳定干扰的慢病毒载体;CPNE1基因稳定干扰能促进Saos-2细胞的凋亡并抑制细胞生长;CPNE1基因沉默后,Saos-2细胞基因表达谱发生明显变化,表明CPNE1基因表达与相关基因及信号通路的调控有关。
【关键词】：慢病毒 RNA干扰 人骨肉瘤细胞Saos-2 CPNE1
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R738.1
【目录】：

• 摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 引言10-17
• 参考文献14-17
• 第一部分 靶向CPNE1 基因shRNA慢病毒载体的 构建与鉴定17-48
• 1 材料和方法17-31
• 2 结果31-46
• 3 讨论46-48
• 第二部分 慢病毒介导的CPNE1-siRNA对骨肉瘤细胞Saos-2 抑制作用的体外研究3948-72
• 1 材料与方法48-53
• 2 结果53-66
• 3 讨论66-72
• 小结72-73
• 参考文献73-77
• 综述 骨肉瘤治疗的最新进展77-99
• 参考文献90-99
• 缩略词表99-101
• 攻读学位期间公开发表的论文101-102
• 致谢102-103

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 崔树波;;骨肉瘤中西医结合治疗的进展[J];中国中西医结合急救杂志;2005年06期

  本文关键词：RNA干扰CPNE1基因表达对人骨肉瘤Saos-2细胞生物学行为的影响及其机制，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：504700