NK细胞活化性受体NKp80的融合表达与功能研究

发布时间：2017-07-01 16:21

  本文关键词：NK细胞活化性受体NKp80的融合表达与功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：NK细胞(Natural Killer Cells,NK Cells)是一群参与机体天然免疫的重要淋巴细胞亚群,由于其在杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞中的作用在机体天然免疫中占有重要位置。NK细胞对肿瘤细胞以及病毒感染细胞的杀伤活性主要取决于NK细胞识别靶细胞之后所产生的活化性和抑制性信号的整合和输出,而这两种信号则分别是由NK细胞表面活化性受体和抑制性受体及他们所识别的配体所介导的。天然免疫细胞表面膜蛋白在杀伤细胞识别肿瘤和病毒感染细胞的过程中有着至关重要的作用,而对膜蛋白的识别及杀伤机制的研究一直是免疫学研究的热点问题。NKp80是最近发现的一个重要的NK细胞表面活化性受体,也称为杀伤细胞凝集素样受体亚家族F成员1,是二型跨膜糖蛋白,其胞外端包含一个C型凝集素结构域(CTLD),与NKG2D同属于NKC编码的C型凝集素样受体家族的一员。NKp80以分子量为80kD的二聚体形式主要表达于几乎所有人的NK细胞表面以及一部分效应记忆性的CD8+T细胞,能激活NK细胞毒效应和细胞因子的释放,并且能够与其他活化性受体协同作用诱导NK细胞的活化。NKp80存在的已证实的唯一配体AICL是活化诱导的C型凝集素的简称,同样也被称作CLEC2B,其作为髓样特异性的活化性受体表达于单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些非造血细胞上。AICL与NKp80的相互作用被证实不仅能促进NK细胞对恶性的骨髓细胞的细胞毒性反应,而且还能促使NK细胞和单核细胞的共同活化。在我们的研究中,主要获得的结果包括以下两个部分：1.NKp80分子参与NK细胞活化并增强NK细胞抗肿瘤功能NK细胞的活化及对靶细胞的裂解主要依赖于其表面存在的大量自然杀伤性受体(Natural Cytotoxicity Receptors, NCRs)和NKG2D分子,但是NK细胞同样受其他一些活化性或者共刺激性受体所调控。在这部分研究中我们发现,NKp80作为NK细胞的活化性受体,主要表达在人源的NK细胞上而不表达于人NK细胞系中。通过NKp80抗体介导NKp80受体进行交联后NK细胞上活化性标志分子CD69的表达显著上调,而再导向杀伤实验也进一步证明了NKp80的交联会强烈活化NK细胞,表现为脱颗粒活性和杀伤活性的显著增加,这种活化的水平甚至与经典的NK细胞活化性受体如NCRs和NKG2D等分子所引起的活化水平相当。NKp80与其他活化性受体分子共同交联时还能表现出协同活化NK细胞的作用。另外通过对NK细胞杀伤功能的检测也证明了NKp80的交联能显著增强NK细胞的肿瘤杀伤活性。细胞结合实验证明了NKp80能特异性结合白血病细胞上的AICL分子。通过AICL抗体以及AICL肽段特异性阻断NKp80-AICL相互作用之后观察到NK细胞和肿瘤细胞之间结合形成率受到明显抑制,而反过来通过过表达AICL分子来促进NKp80-AICL相互作用又能显著促进两种细胞结合的形成,这些结果说明NKp80-AICL相互作用参与并促进NK细胞和肿瘤细胞免疫突触的形成。而进一步的杀伤功能实验结果表明不论单独阻断NKp80还是单独阻断AICL分子均能显著抑制NK细胞对白血病细胞的杀伤活性,而同时联合阻断两种分子对NK细胞杀伤能力的抑制作用比单独阻断更为明显,说明了NKp80-AICL相互作用能促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。因此,上述结果证明了NKp80的交联不仅能强烈激发NK细胞的活化以及脱颗粒效应,而且还能与AICL分子相互作用,通过促进NK细胞与白血病细胞之间免疫突触的形成来增强NK细胞的杀伤功能,从而给我们提示了NKp80-AICL受配体系统能帮助NK细胞治疗白血病的可能性及可行性。2. NKp80-Fc融合蛋白的制备及介导NK细胞ADCC功能的研究NK细胞通过Fc受体所介导的效应功能在临床中已得到重要应用,比如抗体介导的细胞杀伤作用(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity, ADCC)。AICL作为NKp80分子已被证实的配体分子高表达于恶性白血病细胞表面(如AML或CML),同时目前临床上也缺乏治疗性的AICL特异性抗体,基于以上原因我们希望寻找能靶向AICL阳性的白血病细胞同时还能诱导NK细胞对其发生ADCC作用的一种有效增强NK细胞抗肿瘤能力的策略,于是我们制备了NKp80-Fc融合蛋白。流式结果显示NKp80-Fc融合蛋白能够特异性结合白血病细胞上的AICL分子,细胞结合实验则证明了NKp80-Fc融合蛋白能够通过ADCC效应显著增强NK细胞和白血病细胞之间免疫突触的形成。在功能实验中,这一融合蛋白的ADCC功能进一步被证实。细胞凋亡及后续的裂解实验表明NKp80-Fc融合蛋白不仅能在细胞结合形成的早期促进NK细胞介导的靶细胞的凋亡,还能在结合后续阶段增强NK细胞脱颗粒活性和杀伤白血病细胞的功能。这种具有双重功能的融合蛋白通过同时结合NK细胞和白血病细胞,不仅能特异性靶向肿瘤细胞,还能通过ADCC功能介导NK细胞对白血病细胞行使强烈的杀伤功能。综上结果,本文中的研究方法对后续研究人员探寻分子靶向治疗措施提供了很好的借鉴,并且这一融合蛋白也将可能会在白血病的免疫治疗方面具有非常广阔的应用前景。
【关键词】：NK细胞 NKp80 AICL 白血病 ADCC
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-16
• 符号说明16-17
• 第一章 绪论17-37
• 1.1 前言17-21
• 1.2 NK细胞的免疫学功能综述21-23
• 1.2.1 NK细胞亚群分布以及特性21-22
• 1.2.2 NK细胞的效应功能22
• 1.2.3 靶细胞的识别22-23
• 1.2.4 NK细胞抑制性和活化性受体23
• 1.3 NK细胞活化性受体NKp80分子综述23-30
• 1.3.1 NKp80分子特征简介23-26
• 1.3.2 NKp80分子的发现及功能26-28
• 1.3.3 NKp80与病毒感染免疫28-30
• 1.4 NKP80配体AICL分子综述30-34
• 1.4.1 NKp80配体AICL的发现及功能30-32
• 1.4.2 NKp80与AICL的相互作用32-34
• 1.5 结语34-37
• 第二章 材料与方法37-45
• 2.1 实验材料与试剂37-39
• 2.1.1 分子生物学相关试剂37-38
• 2.1.2 细胞培养相关试剂38
• 2.1.3 抗体试剂38
• 2.1.4 细胞分选试剂38-39
• 2.1.5 蛋白质技术相关试剂39
• 2.2 实验仪器39-40
• 2.3 实验方法40-45
• 2.3.1 细胞培养技术40-41
• 2.3.2 流式细胞术41
• 2.3.3 ~(51)Cr释放法检测NK细胞的杀伤活性41-42
• 2.3.4 NK细胞脱颗粒功能检测42
• 2.3.5 细胞凋亡检测42
• 2.3.6 细胞结合检测42-43
• 2.3.7 数据统计43-45
• 第三章 NKP80参与NK细胞活化并增强NK细胞抗肿瘤功能45-81
• 3.1 引言45-46
• 3.2 实验结果46-81
• 3.2.1 NKp80分子的mRNA及细胞表达情况46-54
• 3.2.2 NKP80分子的交联激发NK细胞活化54-59
• 3.2.3 NKp80协同其他NK受体分子增强NK细胞肿瘤杀伤活性59-63
• 3.2.4 NKp80配体AICL分子的mRNA及细胞表达情况63-66
• 3.2.5 NKp80特异性结合肿瘤细胞表面的AICL配体66-68
• 3.2.6 NKp80-AICL相互作用参与并促进NK细胞免疫突触的形成68-76
• 3.2.7 NKp80-AICL相互作用增强NK细胞抗肿瘤功能76-81
• 第四章 NKP80-FC融合蛋白的制备及介导NK细胞ADCC功能的研究81-107
• 4.1 引言81-82
• 4.2 实验结果82-105
• 4.2.1 NKp80_Fc融合蛋白单克隆表达细胞株的构建82-88
• 4.2.2 NKp80-Fc融合蛋白的表达及纯化88-92
• 4.2.3 NKp80-Fc融合蛋白能特异性结合白血病细胞表面的AICL配体92-95
• 4.2.4 NKp80-Fc融合蛋白能有效促进NK细胞与白血病细胞免疫突触的形成95-100
• 4.2.5 NKp80-Fc融合蛋白能促进NK细胞介导的白血病细胞的凋亡100-102
• 4.2.6 NKp80-Fc融合蛋白能增强NK细胞的脱颗粒能力102-103
• 4.2.7 NKp80-Fc融合蛋白能显著诱导NK细胞对白血病细胞的ADCC杀伤功能103-105
• 4.3 讨论105-107
• 参考文献107-113
• 致谢113-115
• 攻读博士学位期间的主要研究成果115-116
• 论文发表情况及专利成果115
• 会议论文115-116

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