XPD蛋白的线粒体定位及在线粒体DNA氧化性损伤修复中的功能研究

发布时间：2017-07-19 06:12

  本文关键词：XPD蛋白的线粒体定位及在线粒体DNA氧化性损伤修复中的功能研究

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【摘要】：着色性干皮症D(XPD/ERCC2)编码一种依赖于ATP的解旋酶。XPD在细胞核转录及核苷酸切除修复(NER)中发挥必不可少的作用。在细胞质中,XPD与MMS19形成MMXD复合物在染色体分离及纺锤丝形成中起主要作用。与细胞核DNA相比线粒体DNA中的氧化性损伤是细胞核中的几倍。XPD缺陷细胞的DNA对于氧化性损伤敏感。XPD在维持基因组稳定性上的作用已经得到了很好的证实,但是XPD在线粒体DNA的氧化性损伤修复中是否其起类似的作用仍然是未知的。本研究第一次证明XPD定位于线粒体内。免疫荧光实验显示XPD定位于细胞核,细胞质及线粒体中。通过Western blotting分析提取的细胞组分,进一步证实了XPD蛋白定位于线粒体内。通过蛋白酶K及碱裂解实验证实XPD定位于线粒体基质中。我们观察到在氧化性损伤的条件下XPD在线粒体中的蛋白量明显增加。这一现象明显表明XPD可能在修复线粒体DNA氧化性损伤中起关键作用。与XPD在线粒体中的定位一致,在XPD低表达的U20S细胞及XPD缺陷的人类成纤维细胞中,线粒体ROS的产量及由于氧化性损伤产生的线粒体DNA的common deletion的水平明显升高,而对于线粒体DNA氧化性损伤的修复能力,细胞的ATP水平和线粒体的膜电位则明显降低。实验表明,XPD的缺陷只是影响了线粒体DNA的氧化性损伤修复活性,但是对细胞核基因的修复并没有影响。证明XPD在修复线粒体DNA的氧化性损伤修复机制中是一个关键的因子。通过对线粒体组分的免疫沉淀结合质谱分析进一步检验在修复线粒体DNA氧化性损伤中的与XPD可能相互作用的潜在因子。通过实验发现了两种经典的蛋白MMS19及TUFM蛋白.并且通过免疫共沉淀进一步验证了XPD与两者的相互作用。TUFM是一种线粒体翻译的延长因子Tu,而MMS19在细胞核与细胞质中都发现了可以与XPD相互作用。但是没有发现TUFM与MMS19具有相互作用。与XPD缺陷细胞类似,在TUFM或者MMS19低表达的细胞中也发现了线粒体common deletion水平的增加及修复线粒体DNA氧化性损伤能力的降低。因此与XPD类似,TUFM与MMS19也在线粒体DNA氧化性损伤修复中具有重要作用。我们的发现明显表明XPD促进有效率的线粒体DNA氧化性损伤修复,在保护线粒体基因组稳定性上具有重要作用。XPD形成两种复合物XPD-TUM及XPD-MMS19,这两种复合物在修复线粒体DNA氧化性损伤机制中发挥必不可少的作用。
【关键词】：XPD 线粒体定位 氧化性损伤修复 TUFM MMS19
【学位授予单位】：中国科学院北京基因组研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R758.5
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 专业词汇中英文对照表10-14
• 第一章 引言14-42
• 1.1 DNA损伤修复14-19
• 1.1.1 DNA损伤14
• 1.1.2 细胞核DNA修复与线粒体DNA修复14
• 1.1.3 细胞核中的DNA修复途径14-19
• 1.2 XPD蛋白19-30
• 1.2.1 XPD解旋酶19
• 1.2.2 XPD功能19
• 1.2.3 XPD表型19-22
• 1.2.4 XPD基因型和表型之间的联系22-24
• 1.2.5 XPD结构24-25
• 1.2.6 XPD复合物结构25-30
• 1.3 线粒体30-35
• 1.3.1 线粒体DNA30-31
• 1.3.2 线粒体复合物31-32
• 1.3.3 ROS的产生及氧化性损伤32-33
• 1.3.4 线粒体修复33-35
• 1.4 NER因子在保护及修复氧化性DNA损伤中的作用35-37
• 1.4.1 转录伴随的修复：CSA,CSB及XPG35
• 1.4.2 全基因组修复：XPC及XPA35-37
• 1.5 XPD与氧化性损伤修复37
• 1.6 线粒体疾病37-38
• 1.7 线粒体蛋白质翻译及TUFM蛋白38-40
• 1.7.1 线粒体翻译38-40
• 1.7.2 TUFM蛋白40
• 1.8 本论文研究内容及目的40-42
• 第二章 材料与方法42-64
• 2.1 实验材料42-48
• 2.1.1 所用细胞系的信息42-43
• 2.1.2 所用抗体信息43-44
• 2.1.3 所用质粒信息44
• 2.1.4 引物序列44-46
• 2.1.5 shRNA,siRNA序列46-47
• 2.1.6 所用化学试剂及试剂盒47-48
• 2.1.7 实验仪器48
• 2.2 实验方法48-64
• 2.2.1 RNA的提取及逆转录48-49
• 2.2.2 表达质粒的构建49
• 2.2.3 细胞培养49-50
• 2.2.4 细胞转染50-51
• 2.2.5 过表达及低表达细胞系的建立51
• 2.2.6 免疫荧光51-52
• 2.2.7 细胞组分分离,蛋白酶K处理及碱裂解提出的线粒体52-53
• 2.2.8 双氧水处理实验53-54
• 2.2.9 线粒体超氧化物的测定54
• 2.2.10 ATP水平及线粒体膜电位检测54-56
• 2.2.11 SDS-PAGE凝胶电泳56-58
• 2.2.12 免疫印迹技术58-59
• 2.2.13 基因组提取及长片段PCR(QPCR)59-60
• 2.2.14 检测common deletion60-61
• 2.2.15 大规模线粒体提取及Co-IP(co-immunoprecipitation)61-64
• 第三章 研究结果64-93
• 3.1 免疫荧光试验证明XPD蛋白与线粒体具有共定位64-65
• 3.2 XPD蛋白定位于线粒体中65-67
• 3.3 XPD低表达提高了线粒体中ROS的产量67-69
• 3.4 XPD低表达导致细胞中ATP水平及线粒体膜电位的降低69-71
• 3.5 氧化性损伤压力下XPD在线粒体中的蛋白增加71-72
• 3.6 XPD缺陷导致线粒体DNA产生高水平的common deletion72-73
• 3.7 XPD调控线粒体DNA修复73-76
• 3.8 XPD解旋酶活性在XPD调控的线粒体DNA的修复中有必不可少的作用76-78
• 3.9 纯化XPD蛋白在线粒体中的复合物78-81
• 3.10 TUFM在线粒体的氧化性损伤修复中与XPD起相似的作用81-84
• 3.11 XPD与线粒体BER修复的核苷酸切除修复蛋白CSA,CSB没有相互作用84-85
• 3.12 MMS19定位于线粒体中85-87
• 3.13 线粒体中MMS19与XPD形成独立于TUFM的复合物87-88
• 3.14 线粒体中MMS19低表达影响XPD的表达88-89
• 3.15 线粒体中MMS19低表达影响线粒体功能89-91
• 3.16 XPD在线粒体中形成两种复合物共同调控线粒体DNA修复91-93
• 第四章 分析讨论93-97
• 参考文献97-105
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果105

【相似文献】

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 刘静;XPD蛋白的线粒体定位及在线粒体DNA氧化性损伤修复中的功能研究[D];中国科学院北京基因组研究所;2015年

2 张琪;DNA氧化性损伤的非酶性快速修复可能存在于细胞中[D];兰州大学;2006年

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本文编号：561512