当归补血汤调控红系祖细胞分化的机制

发布时间：2017-07-28 11:35

  本文关键词：当归补血汤调控红系祖细胞分化的机制

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【摘要】：研究的背景和目的红细胞是人体血液中数量最多的一种血细胞,是血液运送氧气的最主要媒介,同时还具有免疫功能,称为人体内的红色卫士。体内红细胞的生成过程是一个复杂的、多步骤的过程,首先由骨髓中多潜能干细胞分化为红系祖细胞(CFU-E和BFU-E),红系祖细胞进一步经过多步骤,最终分化为成熟的红细胞,此过程有多种造血相关细胞和细胞因子参与其中。红细胞是机体中重要的天然免疫细胞,在机体的防御系统中发挥着重要的作用。有许多疾病的发生与红细胞天然免疫功能的变化有关,例如肿瘤、传染病、血液病和自身免疫型疾病等。红细胞在机体免疫反应中的作用主要有：增强吞噬作用、清除循环免疫复合物、识别和携带抗原、免疫调节作用、效应细胞的作用等。临床治疗红细胞减少可以通过红细胞回输的方法来恢复血液中红细胞的数量,但伴有病毒和细菌感染的危险；可以通过静脉补铁来治疗与缺铁相关的贫血,但可能会引起恶心、面部潮红、低血压和过敏反应等副作用,严重的会导致死亡；也可以通过促红细胞生成素(EPO)来促进机体自身红细胞的生成,但是多达10%的贫血病人会因体内产生EPO中和抗体或其它原因而导致治疗失败。EPO作为控制体内红细胞水平的主要细胞因子只是在CFU-E祖细胞分化为成熟红细胞的前期阶段起调控作用,而且体内CFU-E祖细胞的数量限制了EPO促进红细胞生成的能力。因此单纯利用EPO治疗红细胞减少,只能调控红细胞生成的某一环节,不能从根本上对红细胞的生成进行有效调控,同时CFU-E的消耗也会导致BFU-E祖细胞的消耗,从而导致BFU-E祖细胞库的衰竭,继而影响机体的后续造血,已有文献报道用EPO治疗后会导致严重的纯红细胞再生障碍。因此开发给药方便的、多靶点整体调节的,同时又安全有效的促红细胞生成药物是有必要的。补血类中药作为中药的优势药种,尤其是当归补血汤临床应用已有800多年的历史,在促进机体红细胞生成方面临床疗效显著、副作用小。中药特别是复方中药的特点是组成成分复杂、作用靶点多样性,这与中药治疗讲究对机体的整体调节是相一致的,也是中药发挥治疗作用的根本。而中药治疗的这种整体调节性与红细胞生成过程的复杂性也是相一致的。因此中药治疗恰好能够弥补单一细胞因子治疗的缺陷,可以通过多途径、多靶点从根本上来调控红系祖细胞的分化过程,同时治疗成本低。本项目研究的中药组方当归补血汤,出自金元四大家之一李杲的《内外伤辨惑论》卷中,方剂组成为黄芪一两,当归两钱,具有补气生血之功效,主治劳倦内伤,气血虚弱,阳浮于外,肌肤燥热,面红目赤,烦渴引饮,脉洪大而虚,以及妇人经行、产后血虚发热头痛,或疮疡溃后久不愈合者。已有800多年的应用历史,临床疗效显著,特别是对放化疗引起的骨髓抑制有很好的缓解作用。已有文献报道,当归补血汤能够升高外周血中红细胞和骨髓组织中BFU-E和CFU-E祖细胞的数量。经过长期的民间实践验证,具有确切补血作用的中药组方,是值得大力开发的优势药物。本研究将在前人研究的基础上,首先建立当归补血汤质量控制方法以保证后续药效实验结果的重复性和稳定性,后利用小鼠作为动物模型探讨当归补血汤在小鼠体内的促红细胞生成能力,并寻找当归补血汤潜在的作用靶点,为后续体外模型的建立奠定基础,而后利用合适的体外细胞模型来探讨当归补血汤发挥药效作用的机制,最后利用谱效关系来初步探讨当归补血汤发挥药效作用的物质基础。研究内容和结论第一部分当归补血汤质控方法建立1、当归补血汤HPLC色谱条件优化2、当归补血汤HPLC色谱条件方法学验证3、当归补血汤中阿魏酸和芒柄花素含量测定4、当归补血汤共有指纹图谱和共有峰研究主要结论：不同溶剂溶解样品所得色谱峰的数目和分离度不同,95%甲醇用来溶解样品时,所得色谱峰的数目多于其它两种,色谱峰的总峰面积也最高,但通过分析色谱峰的峰形发现,亲水区95%甲醇所获得峰形都比较宽、平且伴有肩峰,峰的对称性和分离度相比另外两种较差,疏水区5%和50%甲醇所获得峰的峰高低于95%,其中5%所获得峰数目较少,峰的峰高较50%和95%低很多,有可能影响峰的检出。建立色谱条件的目的是使更多的化合物能够被检出,因此选择50%甲醇作为溶解样品的溶剂。色谱柱对中药组分的分离有影响,其中Agilent TC-C 18色谱柱所得色谱图对应色谱峰的保留时间较另外两种色谱柱时间延后,并且亲水性药物组分的分离效果显著好于其它两种色谱柱。疏水性药物组分的分离效果三种色谱柱都能做到基线分离。综合以上分析,Agilent TC-C 18色谱柱的分离效果最好。不同流动相的分离能力也有所不同,乙腈洗脱能力强于甲醇,色谱峰出峰时间较快,保留时间较短。甲醇乙酸洗脱系统与其它三种洗脱系统相比色谱图Ⅱ区峰数量较多,分离度较高,峰的对称性较好；Ⅲ区色谱峰乙腈洗脱系统的分离效果较甲醇系统好,但从峰的数目和能否做到基线分离来看,甲醇系统也可以做到基线分离,只是分离度没有乙腈系统高。综合以上分析,我们选择甲醇乙酸系统作为进一步优化的流动相。由于流动相洗脱能力的不同,不同分析物解吸附的时间就有所不同,从而导致峰与峰之间分离度不同。因此我们根据不同阶段峰分离度的不同,采取了不同梯度的洗脱方法来达到最佳的分离效果。最终通过实验取得了良好的色谱峰分离度和基线分离。为了达到控制产品质量的目的,所采取的分析方法必须具有很高的准确性和可靠性,因此需要对所采取方法进行方法学验证。稳定性试验表明不同时间点所得色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱的相似度,均大于0.950,各色谱峰保留时间的RSD均小于0.3%,相对峰高比值的RSD除6和11号峰外(6号6.42%,11号5.09%)均小于5%,说明供试品溶液在24 h内稳定；精密度试验表明6次所得色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱的相似度,均大于0.950,各色谱峰保留时间的RSD均小于0.8%,相对峰高比值的RSD均小于5%,结果表明精密度良好；重复性试验表明6份供试品所得指纹图谱与其所得共有模式图谱的相似度,均大于0.99,各色谱峰保留时间的RSD均小于1.5%,相对峰高比值的RSD均小于5%,结果表明重复性良好。通过比较6批当归补血汤的指纹图谱,共筛选出17个共有峰,共有峰的保留时间RSD均小于0.1%,因此标定此17个峰为共有指纹峰。第二部分当归补血汤调控红系祖细胞分化机制1、当归补血汤小鼠体内促红细胞生成能力及作用靶点研究2、体外细胞模型建立3、当归补血汤促骨髓基质细胞数目增加机制4、当归补血汤体外促红系祖细胞分化机制主要结论：当归补血汤小鼠体内能够促进红细胞生成。单因素方差分析结果表明各组间红细胞、网织红细胞和白细胞数目差异具有统计学意义(F=7.608,P0.001；F=6.391,P=0.001；F=3.067,P=0.028),LSD多重比较表明,当归补血汤高剂量组与模型组相比外周血中网织红细胞的数目显著升高(P0.05),当归补血汤组外周血中红细胞数目与模型组相比无显著性差异。因此得出结论,当归补血汤在小鼠体内能够促进网织红细胞的生成,但对外周血中红细胞的数目影响不大,这可能与外周血中成熟红细胞的生命周期有关。集落形成单位培养实验单因素方差分析结果表明各组间CFU-E和BFU-E克隆数目差异具有统计学意义(F=10.119,P0.001；F=9.346,P0.001),LSD多重比较表明当归补血汤中剂量组和高剂量组骨髓中晚期红系祖细胞的数目与模型组相比显著升高(P0.01),当归补血汤中剂量组和高剂量组骨髓中早期红系祖细胞的数目与模型组相比显著升高(P0.01)。流式结果表明当归补血汤中、高剂量组骨髓中红系相关细胞百分比与模型组相比显著性升高(P0.01)。以上结果表明,当归补血汤可通过促进红系祖细胞增殖和分化来促进红细胞的生成。取不同组骨髓细胞体外培养,以观察骨髓基质细胞的生长状态。结果表明,第三天时各组都有细胞开始贴壁生长,其中当归补血汤低、中、高剂量组和正常组较为显著,贴壁生长细胞约铺满96孔板底的四分之一,而骨髓抑制模型组贴壁细胞细胞数目较少；第六天时当归补血汤高剂量组贴壁细胞已铺板板底的二分之一；培养第九天当归补血汤高剂量组有明显的成纤维细胞克隆形成。细胞周期结果表明,当归补血汤低、中和高剂量组G2M期细胞比例分别为8%、7.4%和7.6%,与模型组相比P0.05,无显著差异。细胞黏附实验表明,当归补血汤中剂量和高剂量组聚集细胞的数目与模型组相比显著著升高,具有显著差异(P0.05)。通过以上动物实验结果,推测当归补血汤调控红系祖细胞分化为成熟红细胞的途径之一,可能是通过增加骨髓基质细胞与红系祖细胞之间的相互接触,并传递促红系祖细胞向成熟红细胞分化的细胞信号来完成。骨髓基质细胞体外培养受到细胞接种密度和培养体系体积的影响。接种1×105个/孔的培养孔基本无骨髓基质细胞生长,接种3×105个/孔细胞的骨髓基质细胞贴壁约30%左右,接种5×105个/孔细胞的基质细胞贴壁达90%左右。3×105个/孔体系组,150μL和200μL培养体系孔骨髓基质细胞的贴壁数目显著低于100μL体系孔(P0.01),而接种细胞数目为5×105个/孔时,各培养体系组骨髓基质细胞贴壁数目无显著差异。当细胞接种密度为3×105个/孔时,条件培养基组与普通培养基组相比能显著促进骨髓基质细胞的生长(P0.05),而细胞接种数目为5×105个/孔时,条件培养基组细胞贴壁数目与普通培养基组无显著差异。结果提示我们条件培养基包含有促骨髓基质细胞体外生长所必须的生长因子,因此骨髓基质细胞在体外培养时自身会分泌胞外因子来促进自身的生长,并且当胞外因子的浓度达到一定浓度后促生长作用达到平台,同时提示我们可以通过利用条件培养基来进行骨髓基质细胞的体外低密度培养。当归补血汤在体外能够增加骨髓基质细胞的细胞数目,在低剂量浓度时促进效果同药物浓度呈剂量依赖关系,随着药物浓度的升高细胞数目增加,但随着药物浓度的进一步增加,促进效果成下降趋势,在药物浓度为1000μg/ml时促进效果最为明显。生长曲线表明当归补血汤组生长曲线斜率高于对照组生长曲线的斜率。细胞周期结果表明,当归补血汤对贴壁细胞的细胞周期无影响,给药组和对照组G1期细胞比例和S、G2M期细胞比例无显著差异；对悬浮细胞细胞周期有影响,G1期细胞比例给药组显著低于对照组(P0.01),S期和G2M期细胞比例给药组显著高于对照组(P0.01)。给药时间实验表明培养4天后再加入当归补血汤对骨髓基质细胞无促进作用。以上实验结果提示当归补血汤促骨髓基质细胞数目增加的机制是通过增加骨髓基质细胞的体外贴壁能力,从而导致骨髓基质细胞细胞的种类不同,从而导致生长曲线斜率的不同,但对体外培养悬浮细胞的增殖有促进作用,这可能与细胞之间的相互通讯有关。体外集落形成实验表明当归补血汤不能直接作用于红系造血祖细胞,需要其它细胞和造血因子的协助。鹅卵石形成实验表明,当归补血汤组克隆形成数目与对照组相比显著升高(P0.01),通过比较两组所形成克隆的大小,当归补血汤组显著大于对照组。因此得出结论,体外在骨髓基质细胞的协助下,当归补血汤能够促进造血祖细胞克隆形成,并且能够使造血祖细胞的增殖分化能力加快。综合以上分析,推测当归补血汤调控红系祖细胞分化为成熟红细胞的其中一种可能作用机制：当归补血汤促进骨髓基质细胞黏附分子的表达,从而增加了骨髓基质细胞与红系祖细胞之间的直接通讯,从而传递红系祖细胞增殖和分化的信号来调控其分化第三部分当归补血汤调控红系祖细胞分化的物质基础1、不同批次当归补血汤的药效学作用2、不同批次当归补血汤药效作用与指纹图谱之间的谱效关系主要结论：不同批次当归补血汤促骨髓基质细胞数目增加的能力有所不同,其中GG组当归补血汤促骨髓基质细胞数目增加的能力显著强于其它组(P0.05)。通过直观比较法和相关系数法探讨当归补血汤指纹图谱与药效学之间的谱效关系。通过比较GG组当归补血汤指纹图谱与其它组指纹图谱的差异,寻找在GG组峰面积最高的特征峰作为当归补血汤潜在的物质基础。又进一步通过统计软件分析了各色谱峰峰面积与药效之间的相关性,以寻找当归补血汤发挥药效的潜在物质基础。通过分析发现,当归补血汤潜在的物质基础主要存在于亲水区。
【关键词】：当归补血汤 红系祖细胞 质量控制 谱效关系 骨髓基质细胞
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 第一章 绪论20-23
• 第二章 当归补血汤质控方法建立23-53
• 1、前言23-25
• 2、材料与方法25-29
• 3、结果与分析29-48
• 3.1 色谱条件优化29-34
• 3.2 色谱条件方法学验证34-43
• 3.3 阿魏酸、芒柄花素含量测定43-46
• 3.4 不同产地指纹图谱分析46-48
• 4、讨论48-53
• 4.1 样品溶解条件的选择49
• 4.2 色谱柱的选择49-50
• 4.3 流动相的选择50-51
• 4.4 梯度优化51
• 4.5 方法学验证51-52
• 4.6 阿魏酸和芒柄花素含量分析52
• 4.7 共有峰和对照图谱建立52-53
• 第三章 当归补血汤调控红系祖细胞分化机制53-90
• 1、前言53-55
• 2、材料与方法55-61
• 3、结果与分析61-84
• 3.1 动物实验61-72
• 3.2 细胞评价模型建立72-76
• 3.3 当归补血汤体外促骨髓基质细胞增殖能力研究76-82
• 3.4 当归补血汤对红系祖细胞直接作用82-83
• 3.5 当归补血汤对红系祖细胞间接作用83-84
• 4、讨论84-90
• 第四章 当归补血汤调控红系祖细胞分化的物质基础90-98
• 1、前言90-91
• 2、材料与方法91-92
• 3、结果与分析92-95
• 3.1 不同产地当归补血汤促骨髓基质细胞贴壁能力92-93
• 3.2 当归补血汤指纹图谱与其药效作用之间的谱效关系93-95
• 4、讨论95-96
• 5、展望96-98
• 参考文献98-107
• 附录107-108
• 博士研究生期间发表论文情况108-109
• 致谢109-112
• 统计学审稿证明112

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本文编号：583884