肺癌生物材料植入白色念珠菌—表皮葡萄球菌生物膜的形成与宿主免疫功能的关系

发布时间：2017-08-02 14:00

  本文关键词：肺癌生物材料植入白色念珠菌—表皮葡萄球菌生物膜的形成与宿主免疫功能的关系

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【摘要】：第一部分：白色念珠菌-葡萄球菌混合生物膜体外模型的建立及结构观察[目的]：建立白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜体外模型,了解混合生物膜的过程及结构特点,评价白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜在不同生物材料表面的形成情况。[方法]：将表皮葡萄球菌成膜阳性株ATCC35984 (Se+)及表皮葡萄球菌成膜阴性株ATCC12228 (Se-)分别与白色念珠菌标准株ATCC10231 (Ca)混合培养建立体外生物膜模型,分为Ca-Se+组与Ca-Se-组,加入聚氯乙烯(PVC)共培养,于共培养2h、6h、12h、24h、48h、72h时,激光共聚焦显微镜检测各组中生物膜厚度、单位视野内菌群落数量,构建生物膜表面三维荧光图片；扫描电子显微镜观察生物膜表面超微结构。在Ca-Se+组分别加入PVC、硅橡胶、聚氨酯材料薄片分为3亚组,于共培养2h、6h、12h、24h、48h、72h时,激光共聚焦显微镜检测各亚组中生物膜厚度。[结果]：激光共聚焦显微镜检测示,Ca-Se+组与Ca-Se-组培养6h开始出现生物膜的生长,12h明显增厚,24h时快速增长,48h最厚,直到72h时生物膜厚度趋于稳定,Ca-Se+组24h及72h形成生物膜厚度大于Ca-Se-组(P0.05), Ca-Se+组PVC材料表面菌落数6h、12h、24h、48h、72h多于Ca-Se-组,差异具有统计学意义(P0.05)。荧光图像及三维重建提示：混合生物膜表面呈现起伏不平丘状隆状,突起部分多为活菌,死菌多分部于丘状隆起间沟壑处；生物膜断层扫描提示：由内向外死活菌比例逐渐降低；Ca-Se+组PVC材料表面成熟生物膜结构较Ca-Se组复杂。扫描电镜结果显示,随着共培养时间增加,PVC材料表面逐渐形成呈团块状、层叠样的复杂立体结构的混合生物膜,可见表皮葡萄球菌和白念珠菌的孢子及假菌丝呈团块状混杂生长,大量表皮葡萄球菌黏附于各种形态的白色念珠菌周围(孢子、假菌丝、菌丝)周围形成多次层复杂网状结构。与Ca-Se-组相比Ca-Se+组中混合生物膜结构更加复杂,白色念珠菌与表皮葡萄球菌黏附更为紧密,生物膜外周白色念珠菌黏附的表皮葡萄球菌数量更多。激光共聚焦显微镜检测提示Ca与Se+在共培养6h、12h、24h、48h、72h时,PVC、医用硅橡胶、聚氨酯各组材料表面生物膜厚度差异明显,医用硅胶组最厚,聚氯乙烯组次之,聚氨酯组最小(P0.05)。共培养2h小时,硅橡胶组生物膜厚度大于聚氨酯与PVC组,差异具有统计学意义(P0.05),聚氨酯与PVC组间生物膜厚度差异无统计学意义(P0.05)。[结论]：表皮葡萄球菌和白色念珠菌混合培养,可在生物材料表面形成结构复杂的混合生物膜,Ca-Se+组形成生物膜较Ca-Se组更厚,结构更复杂。表皮葡萄球菌和白念珠菌在医用硅胶表面形成混合生物膜的能力最强,聚氯乙烯次之,聚氨酯最差。胶、聚氨酯各组材料表面生物膜厚度差异明显,医用硅胶组最厚,聚氯乙烯组次之,聚氨酯组最小(P0.05)。共培养2h小时,硅橡胶组生物膜厚度大于聚氨酯与PVC组,差异具有统计学意义(P0.05),聚氨酯与PVC组间生物膜厚度差异无统计学意义(P0.05)。第二部分：白色念珠菌Efg1、Ecel、Sap5基因及表皮葡萄球菌AltE、 Aap基因在肺癌生物材料植入白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜形成过程中的作用[目的]：探讨白色念珠菌Egfl、Ecel、Sap5基因与表皮葡萄球菌AltE、App基因在肺癌患者生物材料植入白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜形成过程中的表达差异及对混合生物膜形成的影响。[方法]：在表皮葡萄球菌成膜阳性株ATCC35984 (Se+)与白色念珠菌标准株ATCC10231 (Ga)与聚氯乙烯(PVC)共培养过程中,分别加入晚期非小细胞肺癌患者血清与健康人群血清,分为对照组、肺癌组和健康人群组,于共培养2h、6h、12h、24h、48h、72h时,CLSM检测各组PVC材料表面生物膜厚度与菌落数；分别于共培养6h、24h、48h时,荧光定量PCR检测各组PVC材料表面白色念珠菌Efgl.Ecel、Sap5基因和表皮葡萄球菌AltE、Aap基因的表达差异。[结果]：CLSM检测示,共培养6h、12h时肺癌组和健康人群组PVC材料表面菌落数较对照组多,肺癌组PVC材料表面菌落数多于健康人群组(p0.05)；共培养12h、24h、48h时肺癌组混合生物膜厚度大于健康组与对照组,差异具有统计学意义(p0.05)。荧光定量PCR结果显示,三组中AltE随共培养时间增加下调明显,差异具有统计学意义(P0.05),6h时肺癌组AltE表达最低,健康人群组次之,对照组最高,两两比较差异具有统计学意义(P0.01)；三组中Aap表达随共培养时间增加上调明显,6h对照组Aap表达对照组最高、肺癌组次之、健康组最低,两两比较差异具有统计学意义(P0.05)；12h时Aap表达肺癌组最高、健康组次之、对照组最低,两两比较差异具有统计学意义(P0.05)；三组中Efg1随共培养时间增加下调明显,差异具有统计学意义(P0.05),6h时肺癌组Efg1表达最高,健康人群组次之,对照组最低,两两比较差异具有统计学意义(P0.01),12h时健康组Efg1表达肺癌组、健康人群组与对照组,两两比较差异无统计学意义(P0.05),48h时肺癌组与健康Efg1表达差异无统计学意义(P.05),但低于对照组(P0.05)。三组中Ecel表达随共培养时间增加上调明显,6h对照组Ecel表达对照作用最高、肺癌组次之、健康组最低,两两比较差异具有统计学意义(P0.05),24h时,肺癌组与对照组Ecel表达低于健康人群组,差异具有统计学意义,肺癌组与对照组之间差异无统计学意义(P0.05)。三组中Sap5表达随共培养时间增加而上调明显,6h时三组Sap5表达对照组最高、肺癌组次之、健康组最低,两两比较差异存在统计学意义(P0.05)；48h时,Sap5表达肺癌组最高,健康组次之,对照组最低,两两比较差异有统计学意义(P0.05)。[结论]：与健康人群相比表皮葡萄球菌和白念珠菌混合培育更易在植入肺癌患者生物材料表面形成混合生物膜,可能与共培养早期白色念珠菌Efg1表达量下调、Ecel、Sap5基因表达量上调及表皮葡萄球菌AltE、Aap基因表达量下调有关。次之,对照组最高,两两比较差异具有统计学意义(P0.01)；三组中Aap表达随共培养时间增加上调明显,6h对照组Aap表达对照组最高、肺癌组次之、健康组最低,两两比较差异具有统计学意义(P0.05)；12h时Aap表达肺癌组最高、健康组次之、对照组最低,两两比较差异具有统计学意义(P0.05)；三组中Efg1随共培养时间增加下调明显,差异具有统计学意义(P0.05),6h时肺癌组Efg1表达最高,健康人群组次之,对照组最低,两两比较差异具有统计学意义(P0.01),12h时健康组Efg1表达肺癌组、健康人群组与对照组,两两比较差异无统计学意义(P0.05),48h时肺癌组与健康Efg1表达差异无统计学意义(P.05),但低于对照组(P0.05)。三组中Ecel表达随共培养时间增加上调明显,6h对照组Ecel表达对照作用最高、肺癌组次之、健康组最低,两两比较差异具有统计学意义(P0.05),24h时,肺癌组与对照组Ecel表达低于健康人群组,差异具有统计学意义,肺癌组与对照组之间差异无统计学意义(P0.05)。三组中Sap5表达随共培养时间增加而上调明显,6h时三组Sap5表达对照组最高、肺癌组次之、健康组最低,两两比较差异存在统计学意义(P0.05)；48h时,Sap5表达肺癌组最高,健康组次之,对照组最低,两两比较差异有统计学意义(P0.05)。第三部分：肺癌生物材料植入白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜对细胞免疫的影响[目的]：比较肺癌患者与健康人群外周血单个核细胞(PBMCs)在白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜刺激下,TLR2、TLR4、TLR9受体表达,T淋巴细胞分化及相关细胞因子分泌的变化。[方法]：采用密度梯度离心法分离晚期肺癌患者和健康人群外周血单个核细胞各10例。表皮葡萄球菌成膜阳性株ATCC35984 (Se+)与白色念珠菌标准株ATCC10231 (Ca)与聚氯乙烯(PVC)共培养48h后,取出PVC材料,分离混合生物膜上清液。分为肺癌组与健康人群分别加入混合生物膜上清液共培养24h,采用Real-time法测定培养前后PBMCs细胞TLR2、TLR4、TLR9的表达水平；流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测PBMCsCD3+、CD4+、CD8+、 CD3+CD25+、CD4+ CD25+细胞数量培养前后变化,检测各组培养前后上清液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF浓度。[结果]：(1)RT-PCR结果提示：共培养前肺癌组PBMCs细胞相比TLR2、TLR4表达低于健康人群组(P0.05),TLR9.两组间无明显差异(P0.05)。与白色念珠菌-表皮葡萄球菌生物膜上清共培养24h后,肺癌组与健康人群组PBMCs细胞TLR2、TLR4、TLR9表达肺癌组下调程度高于健康人群组(P0.05)；(2)流式细胞检测提示：与对照组共培养肺癌组与健康人群组Th1因子：IL-2、TNF、IFN-γ浓度下降明显(P0.05),Th2因子：IL-4、IL-10浓度上升明显(p0.05),肺癌组的Th1因子下调程度高于健康人群组(p0.05),Th2因子的上调程度程度高于健康人群组(p0.05)；(3)共培养前肺癌组与健康人群组相比CD3+、CD4+、CD8+细胞比例低于健康人群组,CD4+CD25+细胞比例高于健康人群组；共培养24小时后与对照组相比,与对照组相比较两组CD3+、CD4+、细胞比例下降显著(p0.05), CD8+、CD4+CD25+细胞比例上升显著(p0.05)；肺癌组CD3+、 CD4+、细胞比例下降程度小于健康人群组(p0.05),肺癌组CD8+、CD4+CD25+细胞比例上升程度小于健康人群组(p0.05)。[结论]：白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜上清液能下调人外周血单个核细胞TLR2、TLR4、TLR9的表达,导致机体的细胞免疫应答朝着Th2型免疫反应发展,从而引起细胞因子表达量的变化,这可能是肺癌患者BF相对健康人群容易逃脱机体免疫防御系统。
【关键词】：表皮葡萄球菌 白色念珠菌 混合生物膜 PVC 医用硅橡胶 聚氨酯 非小细胞肺癌 表皮葡萄球菌 白念珠菌 生物材料 混合生物膜 Ffg1 Ecel Sap5 AltE Aap 白色念珠菌 表皮葡萄球菌 生物材料 混合生物膜 肺癌 细胞免疫 细胞因子 Th1 Th2
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中英文缩略词对照表7-9
• 研究背景9-13
• 中文摘要13-17
• Abstract17-23
• 第一部分：白色念珠菌-葡萄球菌混合生物膜体外模型的建立及结构观察23-64
• 前言23-25
• 材料与方法25-31
• 结果31-55
• 讨论55-60
• 结论60
• 致谢60-61
• 参考文献61-64
• 第二部分：白色念珠菌Efg1、Ecel、Sap5基因及表皮葡萄球菌AltE、Aap基因在肺癌生物材料植入白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜形成过程中的作用64-95
• 前言64-66
• 材料与方法66-73
• 结果73-85
• 讨论85-90
• 结论90-91
• 参考文献91-95
• 第三部分：肺癌生物材料植入白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜对细胞免疫的影响95-125
• 前言95-97
• 材料与方法97-107
• 结果107-113
• 讨论113-121
• 结论121
• 致谢121-122
• 参考文献122-125
• 全文总结125-126
• 综述126-150
• 参考文献143-150
• 攻读博士学位期间主持及参与课题150
• 攻读博±期间科研获奖150-151
• 攻读博士学位期间发表文章151-152
• 致谢152

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 雷玉洁;黄云超;陈小波;赵光强;杨凯云;陈颖;;非小细胞肺癌患者转化生长因子β1水平与机体免疫状态的关系[J];中国临床医学;2011年05期

2 苏艳;段继周;段东霞;蔺存国;张杰;侯保荣;杨东方;;材料表面性质对微生物附着行为的影响[J];海洋科学;2012年12期

3 许颖;刘亚男;赵亮;;白色念珠菌生物膜中胞外DNA分布观察[J];黑龙江医药科学;2009年03期

4 饶钟鸣;黄云超;雷玉洁;;肺癌患者以生物材料为中心细菌感染的研究进展[J];现代肿瘤医学;2013年04期

5 陈宝林;王东安;;血液相容性抗凝血生物医用高分子材料的制备及其机制(英文)[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年29期

6 叶联华;黄云超;杨达宽;赵光强;刘馨;郭凤丽;周友全;;表皮葡萄球菌ica操纵子与聚氯乙烯材料表面细菌生物膜形成的关系[J];中华医院感染学杂志;2010年24期

7 叶联华;黄云超;许赓;杨达宽;刘馨;周友全;郭凤丽;;医源性表皮葡萄球菌胞间黏附素基因操纵子在聚氯乙烯材料表面细菌生物膜形成中的作用研究[J];中国修复重建外科杂志;2011年04期

8 许亚夫;;抗菌生物材料的抗细菌黏附能力[J];中国组织工程研究;2012年51期

9 戚韩英;汪文斌;郑昱;朱亮;徐向阳;;生物膜形成机理及影响因素探究[J];微生物学通报;2013年04期

10 黄娟;杨维青;赵祖国;;细菌生物被膜菌群间遗传物质的转移[J];中国抗生素杂志;2013年02期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 雷玉洁;转化生长因子β1、ica操纵子对肺癌患者生物材料细菌生物膜形成的影响[D];昆明医科大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 尤峰;在念珠菌系统性感染中TLR-4、IL-17表达水平的研究[D];华中科技大学;2011年

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本文编号：609589