P203L和V395I突变在N0K介导的肿瘤生成与转移中的作用

发布时间：2017-08-04 04:27

  本文关键词：P203L和V395I突变在N0K介导的肿瘤生成与转移中的作用

  更多相关文章： NOK 突变 肿瘤发生和转移 信号通路

【摘要】：受体型酪氨酸激酶是存在于机体内一类具有广泛生理调节作用的蛋白酶类,它们调控着细胞许多生理生物学活动,包括细胞的增殖与分化、细胞的周期调控与代谢、胚胎的形成于发育等等。NOK(Novel Oncogene with Kinase Domain)是一个最新被鉴定的受体型酪氨酸激酶。NOK因缺少完整的胞外结构域和DFG结构域而因此被认为是一类不具备生物学活性的假激酶。尽管如此,我们实验室通过前期工作发现,NOK是一个癌基因,能在体内诱导癌症的发生和转移。目前,关于NOK的研究并不多,其导致肿瘤生成和转移的具体分子机制也不清楚。本研究旨在从NOK基因结构出发,寻找其结构与功能之间的关联性,明确NOK导致肿瘤生成和转移的信号通路,为阐明其分子机制,为癌症的诊断和治疗提供分子生物学基础。本研究利用体外定点突变技术克隆构建了含有不同位点突变和结构域突变的共九个NOK突变子,并分别构建了pCDNA3.0-NOK-HA/NOK-Mutant-HA真核表达质粒和pCDH-CMV-MCS-EF 1-GFP-CD511B-NOK-HA/NOK-Mutant-HA慢病毒包装质粒及相应BaF3稳定细胞系。我们首先检测了STYK1(即P203L突变)和V395I突变对自身磷酸化水平和激酶活性的影响。结果发现STYK1和V395I突变均未影响到NOK的激酶活性,但V395I轻微抑制了自身的磷酸化。随后,我们研究了突变对信号通路的影响。在HEK293T细胞中,NOK的高表达能显著性升高ERK和Akt的磷酸化程度。但突变V395I并未削弱NOK所介导的ERK和Akt的磷酸化,而突变STYK1则抑制了这两条信号通路。并且,两者都抑制了诸如STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化活化。在HeLa田胞中,STYK1同时抑制了ERK和Akt的磷酸化,但V395I仅抑制了ERK的磷酸化。而在JAK-STAT这条信号通路中,STYK1和V395I均抑制了STAT1和STAT3的磷酸化水平,但是对STAT5的影响不明显。最后,在稳定细胞系中,我们发现突变STYK1和V395I不仅显著性地抑制了STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化,而且还抑制了ERK的磷酸化。同时,STYK1而非V395I显著性地降低了NOK的磷酸化水平。细胞增殖试验检测了突变对细胞增殖的影响。发现STYK1和V395I抑制了细胞的增殖能力。我们还发现与NOK相比,STYK1组诱导的集落形成数量明显降低,约为NOK组的1/35,V395I组的集落形成数量也有降低,约为NOK组的1/4。以上结果说明了突变STYK1和V395I抑制了NOK介导的细胞的增殖和转化及相关信号的传导。在动物模型中,我们研究了NOK及其突变体在裸鼠体内的成瘤能力和相应的肿瘤转移能力。发现与对照组细胞相比,实验组均可以导致肿瘤的形成和转移,但和NOK组的成瘤能力相比,突变组导致肿瘤形成的能力减弱,肿瘤形成的时间明显滞后。在实验组中,NOK组裸鼠平均存活时间约为1.5月,而STYK1组和V395I组裸鼠平均存活时间约延长至2.5-3.0月。各脏器肿大情况以NOK组最为明显,其中肝脏和脾脏的肿大较STYK1组和V395I组严重。在NOK组裸鼠的肝脏表面可见明显结节状肿瘤转移灶甚至成片转移灶,而在注射突变子的裸鼠肝脏表明则很少看到明显转移灶的产生。苏木精-伊红(HE)染色发现,在V395I和STYK1中,V395I组肝脏和脾脏的浸润程度均高于STYK1组。我们利用流式细胞仪分析了各脏器中肿瘤的转移情况,并进行了肿瘤转移的相对定量分析,结果也显示了各脏器肿瘤侵袭的不同情况。此外,利用免疫沉淀和质谱鉴定技术,我们研究了与NOK可能发生相互作用的蛋白。用质谱技术鉴定到了约40余种有可能与NOK发生相互作用蛋白,并且这些蛋白都是功能研究比较少的,其中有至少1/4为未知功能蛋白。包括MY09, MYO10, MYO14, FLNA, EHILI, BCLF1, MCM5, LAS1L, FAS, MYO6, U520和DZSP等等,其中不乏与肿瘤转移相关的蛋白如MYO10和MYO6等。这些蛋白可能在NOK介导的肿瘤生成和转移过程中发挥着关键作用。本研究从体外细胞水平和体内动物水平上探讨了NOK结构和功能之间的相关性,通过突变子和稳定细胞系的构建为实验室研究NOK的结构和功能建立了良好的研究平台。通过本研究,为寻找对NOK所介导的肿瘤的发生和转移的具体机制提供了重要理论依据,也为以后更深入地研究NOK的功能提供了重要的线索。
【关键词】：NOK 突变 肿瘤发生和转移 信号通路
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-37
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 前言8-14
• 材料与方法14-50
• 一、实验材料14-28
• 二、试剂配制28-31
• 三、方法31-50
• 结果50-89
• 一、NOK及其突变体的构建50-55
• 二、慢病毒包装稳定细胞系的建立55-59
• 三、STYK1和V395I对NOK自身磷酸化和酪氨酸激酶活性的影响59-60
• 四、STYK1和V395I对相关信号通路的影响60-64
• 1、HEK293T细胞和HeLa细胞60-62
• 2 、BaF3稳定细胞系62-64
• 五、STYK1和V395I对细胞增殖的影响64-68
• 六、STYK1和V3951抑制了NOK介导的锚定非依赖生长特性68-70
• 七、STYK1和V395I对细胞周期的影响70-72
• 八、STYK1和V395I对细胞迁移和侵袭的影响72-80
• 1 、体外细胞水平72-74
• 2 、体内动物水平74-80
• 九、STYK1和V395I对肿瘤生成的影响80-83
• 1、生存曲线80-81
• 2 、脏器分析81-83
• 十、NOK相互作用蛋白83-89
• 讨论89-97
• 参考文献97-103
• 文献综述103-117
• 参考文献113-117
• 附录117-120
• 致谢120-122

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本文编号：617761