脾脏截留循环内皮祖细胞及高原环境对大鼠颅脑损伤修复的影响

发布时间：2017-08-05 22:22

  本文关键词：脾脏截留循环内皮祖细胞及高原环境对大鼠颅脑损伤修复的影响

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【摘要】：创伤性脑损伤(TBI)是全球范围内45岁以下人群致死致残的首要原因,可以减少伤者的预期寿命。其中重型TBI患者死亡率高达35-70%,绝大部分幸存者均遗留不同程度的功能障碍,针对重型TBI迄今为止仍无有效的治疗策略降低死残率。重型TBI患者的死亡除与年龄大小、原发损伤严重程度、救治是否及时等因素有关外,继发性脑损伤所致创伤性脑水肿已成为影响预后的重要因素。因此,如何有效控制继发性脑损伤的进展以减轻创伤性脑水肿,对降低重型TBI死亡率具有重要的临床价值及科学意义。TBI后血管新生是创伤后的一种保护性机制,可减轻神经组织继发性损伤。对TBI的研究目前主要聚焦于脑保护及神经修复再生,而对脑组织缺血区供血血管关注甚少。研究证实在成年人外周血中存在的EPCs能分化为血管内皮细胞,在体内具有生成血管的能力,血管新生已成为当前再生医学领域关注的热点,随着对EPCs认识的加深,既往认为只能靠成熟内皮细胞对损伤血管进行有限修复的观点被颠覆。EPCs在各种因素刺激下可从骨髓及其它组织动员到循环血进行损伤的修复。近年来研究显示,EPCs是参与生后生理性及病理性血管形成最主要的细胞,同时可在体内分化为内皮细胞,并参与脑、心、肝、肾等内脏器官损伤时的修复。因此,EPCs在TBI后修复中具有重要的治疗作用及广阔的应用前景。BBB在维持CNS与血循环之间的内稳态起着重要作用,重型TBI后BBB破坏,继发创伤性脑水肿形成是重型TBI患者死亡的首要原因。近来研究认为BBB被推荐为TBI一个有希望的治疗靶标,稳定BBB与神经保护剂两者结合可以提高治疗成功率。在影响TBI后神经功能恢复及远期预后的诸多因素中,BBB修复是其中尤为重要的因素;而EPCs可转化为内皮细胞参与血管新生并修复内皮完整性,进而防止BBB损伤、加快神经功能恢复。亦有研究表明循环EPCs水平与TBI临床严重程度及预后有关,可作为TBI预后的一个潜在标志物。当前对重型TBI的大量研究多关注脑组织本身,针对外周免疫反应对TBI的影响缺乏深入研究。近年来研究表明,TBI后继发性脑损伤过程中除致伤灶内炎症因子参与外,外周免疫系统亦参与了该过程,促进创伤性脑水肿形成,作为人体最主要的免疫器官,脾脏在TBI后脑水肿形成中有重要作用。脾脏亦是机体最大的淋巴器官,约占体重的0.2%,在清除衰老红细胞、产生抗体及诱导免疫方面发挥重要功能,脾监视循环并清除血中潜在威胁内环境稳定的异物。脾脏一直被认为是单核细胞的直接贮库,机体损伤后动员大量单核细胞直接入脾,研究报道在炎性疾病中脾脏受累及,在脾脏中单核细胞数量不仅比循环中高出数倍,而且在内环境稳定情况下心肌梗塞后受损心脏单核细胞数量亦超出循环。有研究报道实验性卒中导致脾萎缩及脾源性促炎单核巨噬细胞动员进入血循环,进而聚集在缺血脑组织,脾尺寸的减少与脑梗塞面积程度呈负相关,卒中前2周行脾切除术具有神经保护作用。课题组前期研究证实,重型TBI大鼠伤后立即行脾脏切除,能够有效减轻脑组织水肿程度,显著降低大鼠死亡率,并能改善其认知功能,但具体机制尚不清楚。既然循环EPCs水平与TBI临床严重程度及预后有关,而在TBI后行脾切除可以减轻脑水肿,两者之间是否存在某种重要联系?脾切除对循环EPCs水平及BBB通透性会产生什么影响?脾切除是否介导EPCs参与BBB重建?为验证上述疑问,本研究设计如下实验,以明确脾脏在重型TBI后对循环EPCs的调控及其参与BBB修复的机制。除了从内因方面探讨了重型TBI后脾脏对EPCs的影响及其参与BBB修复、减轻了创伤性脑水肿,我们还从外因方面初步探讨了环境改变对重型TBI后创伤性脑水肿的影响,对常压、低压环境下穿透性脑损伤的伤情进行比较,以对高原条件下创伤性脑水肿的诊治提供依据。研究内容:①建立重型TBI大鼠模型,观察TBI后立即行脾脏切除对大鼠伤情的影响,主要从血常规、血糖、死亡率及脑水肿等方面观察;②对重型TBI后3天大鼠循环血单个核细胞进行分离、培养及基本生物学特性鉴定;③脾切除对重型TBI大鼠循环血EPCs及S100B蛋白的影响及两者间的相互关系,制模后不同时间点应用流式细胞仪检测循环血EPCs,应用ELISA检测血浆S100B蛋白表达;④重型TBI大鼠BBB通透性的改变情况以及脾切除后对BBB通透性的影响;利用携带EGFP的慢病毒载体转染EPCs,经尾静脉移植后,观察EPCs移植后对创伤性脑水肿的影响及其参与血脑屏障重建的机制,应用免疫荧光了解其归巢至脑损伤灶情况,Western blot检测GFP及VEGF蛋白的表达;⑤对模拟高原穿透性颅脑损伤伤情的特点进行初步研究,通过建立穿透性脑损伤模型,从死亡率、组织病理改变、脑含水量、EB含量、局部脑血流量、局部脑氧分压、脑干听觉诱发电位等方面比较常压及低压环境对穿透性脑损伤伤情的影响。本次研究得出如下结果:①建立了稳定的大鼠重型TBI模型;进一步印证了重型TBI大鼠伤后行脾切除可有效缓解脑水肿,提高生存率。②应用密度梯度离心从循环血分离获得的单个核细胞中存在EPCs,在内皮条件培养基诱导培养下可由祖细胞向成熟细胞分化;所培养EPCs经流式细胞仪鉴定具有EPCs表型特征,并可摄取Di I-Ac-LDL及结合FITC-UEA-1;EPCs在Matrigel上能形成小管样结构。③重型TBI后循环血EPCs增加,脾切除后循环血EPCs增加更为显著;重型TBI后血浆S100B蛋白表达增加,脾切除可以减少其表达;EPCs与血浆S100B蛋白呈正相关。④大鼠TBI后BBB通透性增加,脾切除可以改善BBB通透性;TBI后行EPCs移植减轻创伤性脑水肿;EPCs参与了TBI后BBB的重建,VEGF可能是EPCs修复血脑屏障的分子机制。⑤高原创伤性脑水肿较常压伤情重、发生快,持续时间长;早期持续的r CBF与Pbt O2监测对高原穿透性脑损伤的诊治具有重要价值。研究结论:1重型TBI后BBB通透性升高,脾切除可改善BBB通透性;2重型TBI后行脾切除可以升高循环EPCs,提示脾脏对骨髓来源的EPCs具有截留作用;3重型TBI后EPCs移植可归巢到损伤灶参与BBB重建,减轻创伤性脑水肿;4高原创伤性脑水肿伤情重、发生快、持续时间长,早期持续的r CBF与Pbt O2监测对指导治疗具有重要意义。
【关键词】：脾切除 内皮祖细胞 创伤性脑损伤 血脑屏障 脑水肿
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.15
【目录】：

• 缩写语表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 脾脏切除对重型颅脑损伤大鼠伤情的影响16-26
• 2.1 材料与方法16-19
• 2.2 结果19-23
• 2.3 讨论23-25
• 2.4 小结25-26
• 第三章 重型颅脑损伤大鼠循环EPCs的分离、培养及基本生物学特性26-38
• 3.1 实验材料与方法26-31
• 3.2 结果31-34
• 3.3 讨论34-36
• 3.4 小结36-38
• 第四章 脾脏切除对重型TBI后循环EPCs的影响38-52
• 4.1 材料与方法39-44
• 4.2 结果44-48
• 4.3 讨论48-51
• 4.4 小结51-52
• 第五章 EPCs移植治疗促进TBI血脑屏障重建的作用机制52-66
• 5.1 材料与方法52-59
• 5.2 结果59-63
• 5.3 讨论63-65
• 5.4 小结65-66
• 第六章 模拟高原环境大鼠开放性颅脑创伤伤情的研究66-78
• 6.1 材料与方法66-71
• 6.2 结果71-75
• 6.3 讨论75-77
• 6.4 小结77-78
• 全文总结78-79
• 参考文献79-87
• 文献综述一 EPCs在脑损伤中的研究进展87-103
• 参考文献95-103
• 文献综述二 脾脏在脑损伤中的作用103-112
• 参考文献107-112
• 攻读博士学位期间发表论文112-113
• 致谢113

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本文编号：627232