DNM1L蛋白介导的线粒体自噬在镉致肝脏毒性中的作用研究

发布时间：2017-08-05 23:25

  本文关键词：DNM1L蛋白介导的线粒体自噬在镉致肝脏毒性中的作用研究

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【摘要】：研究背景镉(Cadmium),是一种毒性非常大的工业和环境污染物。随着我国社会经济的高速发展,重金属元素镉由于其在工业中的广泛应用,对水源,土壤和农产品的污染已经给众多地区的人民健康造成了巨大的危害。镉具有很强的蓄积性,可因生物积累和生物放大对肝脏、肾脏等器官产生一系列损伤。目前,镉已经被美国毒性管理委员会列为第6位危害人类健康的有毒物质。镉可以通过食物链进行转移,也可以经过呼吸道吸入,例如在生产与使用过程中的镉粉尘及吸烟时烟草中的镉。线粒体是镉损伤的重要细胞器之一。研究发现,镉能够引起线粒体DNA(mt DNA)减少,呼吸链蛋白减少,线粒体质量下降。但是这一机制目前仍然不是非常清楚。线粒体自噬是一种选择性的自噬过程,是损伤线粒体降解,维持细胞内环境稳态和线粒体功能重要方法之一。但是过度的或者紊乱的线粒体自噬会导致细胞内线粒体过度降解从而引起细胞能量代谢障碍,甚至细胞死亡。本课题在明确镉引起的肝脏毒性效应的条件下,研究镉是如何引起线粒体丢失,揭示过度的线粒体自噬在镉致线粒体丢失中的重要作用;通过研究Ca2+-DNM1L介导的过度线粒体自噬,探讨线粒体自噬在镉毒性中的重要作用。研究内容①以CCK-8实验等方法评价CdCl2对正常肝脏细胞株L02细胞的毒性效应;进一步检测CdCl2对线粒体质量、ATP含量、线粒体呼吸链复合体IV的蛋白含量以及线粒体DNA的拷贝数等反应线粒体丢失的指标的影响;在镉暴露条件下,检测L02细胞中自噬流的水平。通过蛋白印记实验检测自噬相关蛋白LC3、SQSTM1蛋白水平。电镜观察自噬小体的水平。通过GFP-LC3与TOMM20共定位检测含有线粒体的自噬小体,LysoTraker与Mito Traker共定位检测含有线粒体的自噬溶酶体的变化。进一步通过溶酶体活性抑制剂巴弗洛霉素A检测镉对自噬流的影响。最后,通过调控的线粒体自噬的关键基因ATG5,明确线粒体自噬在镉致线粒体丢失中的重要作用。另外一方面,控制线粒体丢失另一重要环节线粒体生成,我们也检测了调控线粒体生成的两个核心蛋白PPARGC1A和TFAM。②在镉暴露条件下,通过检测L02细胞线粒体的形态来衡量分裂-融合的动态平衡明确镉引起线粒体自噬的机制,检测l02细胞中dnm1l、opa1、mfn1、mfn2、fis1等分子的表达变化,评价该调控轴的活化水平;并对dnm1l的表达进行正负调控,检测相应的线粒体分裂-融合的动态平衡,线粒体自噬的水平以及线粒体质量的变化,验证dnm1l在镉引起的线粒体丢失中的作用。同时,进一步利用两种检测钙水平的探针,精确检测细胞内钙和线粒体内钙水平,并对两种钙离子水平分别进行调控,以明确镉是如何引起线粒体分裂-融合相关蛋白的变化的机制。③以c57bl6/j小鼠腹腔注射可溶性镉化合物氯化镉(cdcl2)为实验模型,运用dnm1l特异性抑制剂mdivi-1进行在体干预,通过检测atp含量、线粒体呼吸链复合体iv的蛋白含量研究镉对小鼠肝脏线粒体丢失的影响。在小鼠出现肝脏功能改变的镉暴露条件下,检测dnm1l的水平和线粒体转位情况,检测线粒体利用电镜评价镉对动物肝脏线粒体形态的影响,蛋白印记实验检测动物肝脏组织的线粒体中lc3和p62的水平,探讨线粒体自噬在镉的肝脏毒性效应中的作用;研究结果①cdcl2对l02细胞造成显著的线粒体丢失效应,并呈现剂量依赖关系;镉能够引起线粒体质量的下降,线粒体呼吸链复合体iv的蛋白含量线粒体dna的拷贝数减少,从而引起细胞的能量代谢障碍,导致肝脏的细胞毒性。cdcl2暴露引起l02细胞lc3蛋白的高表达,sqstm1蛋白的降解,含有线粒体的自噬小体和含有线粒体的自噬溶酶体的高表达,巴弗洛霉素a抑制后进一步加剧了镉引起的自噬水平,从而明确镉能使肝脏细胞的自噬流增加。在暴露镉的l02细胞中,抑制atg5的表达,一定程度上缓解镉引起的线粒体的丢失及细胞毒性;同时,介导线粒体丢失另一个重要环节,线粒体生成并没有受到镉的扰乱。②cdcl2暴露引起l02细胞线粒体分裂-融合的动态平衡的紊乱,能够显著引起线粒体分裂增多,即长条形和棒状的线粒体变成了点状或球形的线粒体;同时,在精确控制线粒体分裂-融合的5种蛋白中,镉暴露仅上调dnm1l的表达,增多的dnm1l蛋白会进一步由胞浆向线粒体转位;在暴露镉的细胞中,抑制dnm1l的表达,一定程度上缓解镉引起的过度的线粒体自噬的发生及线粒体的丢失,从而维持细胞稳态;同时,镉暴露显著引起细胞内钙和线粒体钙水平的增高,抑制细胞内钙能够成功拮抗镉诱导的dnm1l的表达及其线粒体转位,抑制线粒体内钙只能够拮抗dnm1l的转位。③1mgcd/kg的cdcl2经腹腔暴露引起c57bl6/j小鼠在暴露7天后肝脏出现的线粒体丢失和肝脏能量代谢障碍;cdcl2暴露7天后,小鼠肝脏组织中检测到明显的分裂的线粒体和过度的线粒体自噬的发生,然而利用dnm1l蛋白特异性活性抑制剂Mdivi-1,能够显著扭转小鼠肝脏中镉引起的过度线粒体自噬,降低线粒体蛋白COX IV蛋白的减少,维持肝脏细胞正常的能量代谢。研究结论根据本课题的研究结果,获得以下结论:镉通过引起线粒体的丢失,影响肝脏细胞的能量代谢,从而表现出肝脏毒性效应;镉引起的过度的线粒体自噬而不是损伤了线粒体的生成可能是其造成线粒体丢失和肝脏细胞毒性的重要原因;镉暴露引起Ca2+-DNM1L“调控轴”激活,由此造成的线粒体分裂-融合的动态平衡的紊乱可能是镉引起线粒体过度自噬的分子基础。本研究阐述了Ca2+-DNM1L介导的线粒体自噬在镉致线粒体丢失及其肝脏毒性中的重要作用,通过了解DNM1L介导的线粒体分裂和线粒体自噬这一信号通路,为了解镉的肝脏毒性的机制和解毒药物的研发都具有积极意义。
【关键词】：镉 线粒体丢失 线粒体自噬 线粒体分裂 线粒体动力相关蛋白-1 肝脏毒性
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-18
• 第二章 CdCl_2引起过度线粒体自噬导致线粒体丢失造成肝脏细胞毒性18-45
• 2.1 引言18-19
• 2.2 技术路线图19-20
• 2.3 材料与方法20-29
• 2.4 实验结果29-42
• 2.5 讨论42-44
• 2.6 小结44-45
• 第三章 Ca~(~(2+))-DNM1L介导的线粒体分裂-融合在镉诱导的线粒体自噬中的作用45-68
• 3.1 引言45-46
• 3.2 技术路线图46-47
• 3.3 材料与方法47-52
• 3.4 实验结果52-65
• 3.5 讨论65-67
• 3.6 小结67-68
• 第四章 DNM1L抑制剂Mdivi-1 在镉引起的小鼠肝脏功能障碍中的作用68-85
• 4.1 引言68-69
• 4.2 技术路线图69-70
• 4.3 材料与方法70-74
• 4.4 实验结果74-82
• 4.5 讨论82-84
• 4.6 小结84-85
• 全文总结85-87
• 参考文献87-98
• 文献综述 镉毒理作用机制98-126
• 参考文献112-126
• 攻读学位期间的研究成果126-127
• 致谢127

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本文编号：627442