心肌成纤维细胞来源的exosome在血管紧张素-2诱导的心肌肥大中的作用及机制研究

发布时间：2017-08-08 11:12

  本文关键词：心肌成纤维细胞来源的exosome在血管紧张素-2诱导的心肌肥大中的作用及机制研究

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【摘要】：研究背景心肌肥大是长期高血压、冠心病、瓣膜性心脏病、肥厚性心肌病等多种心脏疾病的共同病理过程。心肌肥大的基本特征是心肌细胞体积增大、蛋白质合成速率增加、胶原纤维密度增加、肌节数量增加与结构重组以及胚胎期基因的重新表达。尽管早期的心肌肥大被认为是一种应激状态下的代偿反应,但是长期适应不良性心肌肥大往往伴随着心室扩张、室壁变薄,最终导致心输出量进行性下降、心力衰竭加重和心源性猝死发生率的增加。心肌肥大的主要诱发因素包括机械刺激及多种神经体液因子,前者包括各种压力负荷、容量负荷的刺激,后者包括儿茶酚胺、Ang Ⅱ、ET-1、心房利钠肽(ANP)等,另外某些生长因子如表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)也可诱导心肌肥大。介导病理性心肌肥大刺激与基因活化的信号通路有多条,其中MAPK途径起着至关重要的作用。MAPK家族有ERK、JNK、p38三个主要成员。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS),又称为肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS),对维持人体血压、电解质与体液平衡、心血管系统发育与功能意义重大。现在认为心肌局部RAS在促进心肌重构中的作用,可能较循环RAS更为重要。目前认为在心肌重构中起主导作用的Ang Ⅱ受体是Ang Ⅱ 1型受体(Ang Ⅱ typel receptor, AT1R), Ang Ⅱ 2型受体(Ang Ⅱ type2 receptor, AT2R)的作用尚存在争议。RAS持续激活可使心肌发生肥大、纤维化和坏死,损害心脏功能,最终导致心脏功能由代偿逐渐走向失代偿。心肌成纤维细胞约占正常心肌组织细胞总数的60%-70%,体积约占正常心脏体积的三分之一。心肌成纤维细胞除了产生细胞外基质、为心肌细胞提供支持、参与损伤后修复外,还可以通过分泌Ang Ⅱ、TGFβ1、FGF-1、exosome等影响心肌细胞的生长发育与舒缩功能。Exosome(外泌体)是一种细胞分泌的具有杯状形态、直径约为30-100nm的微囊泡。基本所有的细胞都能分泌exosome, exosome还天然存在于体液中,携带处于不同状态下的细胞产生的蛋白质、miRNA、长链非编码RNA(lncRNA)及mRNA等物质。近年来,exosome因其在细胞间讯的重要作用正得到广泛的关注。本研究旨在从RAS角度揭示心肌成纤维细胞exosome与心肌肥大、心力衰竭的关系。研究目的1.建立心肌成纤维细胞exosome提取体系；2.观察心肌成纤维细胞exosome对心肌细胞肥大的影响,并探讨其机制。研究方法1.细胞培养本实验采用出生1-3天的SD大鼠心脏分离和培养原代心肌细胞和心肌成纤维细胞作为研究对象。2.Exosome制备与鉴定采用差速离心联合密度梯度离心法提取exosome;采用透射电镜与Western blot技术鉴定exosome。3.心肌细胞肥大测定采用心肌细胞平均表面积测量和3H-亮氨酸掺入实验评估心肌细胞肥大。4.实时定量PCR、Western blot、细胞免疫荧光染色采用2-ΔΔCT坩法测定mRNA目对水平。Western blot、细胞免疫荧光实验按标准步骤进行。5.Ang Ⅱ检测采用酶免疫法(The Enzyme Immunoassay, EIA)检测心肌细胞培养上清及心肌成纤维细胞exosome中的Ang Ⅱ含量。9.统计学分析数据采用平均数±标准误形式表示。数据统计采用SPSS 17.0进行,P0.05视为具有统计学差异。研究结果1心肌成纤维细胞条件培养基诱导心肌细胞病理性肥大与对照组相比,心肌成纤维细胞条件培养基(CF CM,50%, V/V)刺激心肌细胞48h明显增加心肌细胞的表面积、蛋白质合成速率,明显升高心肌细胞ANP、BNP、βMHC mRNA表达水平,降低α MHC mRNA表达水平。2替米沙坦能够阻断心肌成纤维细胞条件培养基诱导的心肌细胞肥大相对对照组,CF CM能够明显升高心肌细胞AT1R、AT2R mRNA表达水平。血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1R)拮抗剂替米沙坦(50μ M)能够完全抑制CF CM诱导的心肌细胞肥大,AT2R拮抗剂PD123319(50μ M)能够部分抑制心肌成纤维细胞条件培养基诱导的心肌细胞肥大,两种拮抗剂联用具有协调作用。3心肌成纤维细胞exosome的分离与鉴定本课题中我们采用差速离心联合密度梯度离心法从心肌成纤维细胞条件培养基中提取exosome。透射电镜显示,获得的心肌成纤维细胞来源的囊泡符合exosome的特征：具有双层膜结构与杯状外形；直径多数在40-100nm之间,平均70nm。Western blot实验显示,该种囊泡表达CD9、CD63、HSP70、TSG101这几种exosome标志性蛋白,calnexin表达阴性。同时,该囊泡还表达波形蛋白(vimentin),可见实验中分离获得的囊泡确实是心肌成纤维细胞来源的exosomeo4心肌成纤维细胞exosome能够被心肌细胞摄取我们将PKH67绿色荧光标记的exosome与心肌细胞共培养,然后使用活细胞共聚焦显微镜观察CF exosome与心肌细胞之间的相互作用,发现心肌成纤维细胞exosome能够被心肌细胞摄取。5心肌成纤维细胞exosome能够促进心肌细胞病理性肥大相对于对照组,50 μ g/ml的CF exosome刺激心肌细胞48小时明显增加心肌细胞的表面积、蛋白质合成速率,明显升高心肌细胞ANP、BNP、β MHC mRNA 表达水平,降低a MHC、SERCA2a的mRNA表达水平。另外,10 μ g/ml的CF exosome促心肌细胞肥大能力与Ang Ⅱ(1μM)相当。1-50 μ g/ml的CF exosomes降低SERCA2a mRNA表达水平的作用均强于Ang Ⅱ (1μM)。6去除exosome能够降低心肌成纤维细胞条件培养基的促肥大能力我们采用110,000g离心过夜的方法将exosome从心肌成纤维细胞条件培养基中尽可能地去除。3H-亮氨酸掺入实验显示,去除exosome的CF CM的促肥大能力低于正常CF CM,去除exosome降低了CF CM的促肥大能力。7心肌成纤维细胞exosome能够激活心肌细胞肾素-血管紧张素系统,增加心肌细胞Ang Ⅱ分泌量相对对照组,心肌成纤维细胞exosome与心肌细胞共培养48h显著升高了心肌细胞血管紧张素原(AGT)、肾素(renin)、AT1R、AT2R的mRNA表达水平,显著降低了血管紧张素转化酶-2(ACE2)的mRNA水平。酶免疫实验(EIA)数据显示：相对对照组,心肌成纤维细胞exosome与心肌细胞共培养48h明显增加了心肌细胞Ang Ⅱ分泌量。8 EIA数据显示,心肌成纤维细胞来源的exosome中不含有Ang Ⅱ。9替米沙坦、PD123319能够阻断心肌成纤维细胞exosome的促心肌细胞肥大作用3H-亮氨酸掺入实验显示,AT1R拮抗剂替米沙坦、AT2R拮抗剂PD123319能够浓度依赖性地抑制CF exosome引起的心肌细胞肥大。50μM的替米沙坦与PD123319能够分别完全阻断CF exosome引起的心肌细胞肥大,并且二者联用具有协同作用。10 ERK、JNK、p38通路磷酸化抑制剂能够抑制心肌成纤维细胞exosome激活的肾素-血管紧张素系统、Ang Ⅱ分泌Western blot实验结果显示,CF exosome能够激活心肌细胞内ERK、JNK、 p38通路。接下来的数据显示,CF exosome升高心肌细胞AGT、AT1R、AT2R mRNA以及降低ACE2 mRNA的作用能够被ERK、JNK、p38磷酸化抑制剂所阻断。另外,CF exosome诱导心肌细胞Ang Ⅱ分泌量增加的作用也可以被ERK、JNK、p38磷酸化抑制剂所阻断。11抑制ERK、JNK、p38通路磷酸化能够阻断心肌成纤维细胞exosome诱导的心肌细胞肥大3H-亮氨酸实验结果显示,CF exosome的促心肌细胞肥大作用能够被ERK、JNK、 p38通路磷酸化抑制剂所阻断。研究结论1心肌成纤维细胞分泌的exosome能够通过AngⅡ受体诱导病理性心肌细胞肥大；2心肌成纤维细胞exosome是心肌成纤维细胞诱导病理性心肌细胞肥大的重要途径；3 ERK、JNK、p38通路磷酸化介导了心肌成纤维细胞exosome诱导的心肌细胞肥大；4心肌成纤维细胞exosome通过激活心肌细胞肾素-血管紧张素系统、促进心肌细胞分泌Ang Ⅱ促进心肌细胞肥大；5心肌成纤维细胞exosome激活肾素-血管紧张素系统依赖于MAPK通路磷酸化；综上所述,我们发现心肌成纤维细胞分泌的exosome能够通过MAPK通路激活心肌细胞肾素-血管紧张素系统,从而诱导心肌细胞产生病理性肥大。研究背景心脏疾病是全世界死亡率最高的疾病’,心力衰竭是各种心脏疾病的终末期阶段。目前慢性心衰的防治策略已经从过去单纯强心转变为目前的调节心肌重构,抑制Ang Ⅱ、儿茶酚胺等神经体液因子的过度激活。心肌重构在组织学上表现为心肌肥大与纤维化；细胞学上表现为心肌细胞肥大、心肌细胞凋亡,心肌成纤维细胞增殖与细胞外基质分泌增加。多种刺激因素均可导致心肌重构,包括机械牵张、压力负荷及多种神经体液因子如儿茶酚胺、血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ).内皮素-1(ET-1)、心房利钠肽(ANP)等,某些生长因子如表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)也可诱导心肌重构。机械牵张、压力负荷既可以通过跨膜的细胞外基质受体将刺激信号导入细胞内,也可以通过激活儿茶酚胺、Ang Ⅱ、ET-1等激活心肌细胞肥大与成纤维细胞增殖的相关通路。可见,AngⅡ是心肌重构的重要参与者。Ang Ⅱ可诱导即刻早期反应基因的表达和蛋白质合成的增加,表现为收缩血管,增强心肌收缩力,触发心肌肥大、纤维组织和血管增生。然而,这些适应性反应是许多心血管事件的独立危险因素。在心肌重构的过程中,SERCA2a活性降低是心脏功能失代偿、走向心衰的重要机制。转基因过表达SERCA2a可以调高心脏的泵功能,改善血流动力学状况,使患者远期受益。论文Ⅰ中,我们发现CF exosome能够促进心肌细胞分泌Ang Ⅱ,降低心肌细胞SERCA2a mRNA表达水平。可见,在体内水平CF exosome可能作为一个种旁分泌途径参与了Ang Ⅱ诱导的心肌重构。研究目的探索AngⅡ对心肌成纤维细胞exosome的分泌与促肥大作用的影响,阐释CFexosome在AngⅡ诱导的心肌重构与左心室SERCA2a表达水平降低中的的作用。研究方法1.细胞培养本实验采用出生1-3天的SD大鼠心脏分离和培养心肌原代细胞和心肌成纤维细胞作为研究对象。2.Exosome制备与鉴定采用超速离心联合密度梯度离心法提取exosome;采用透射电镜、Wetern blot技术鉴定CF exosome。3细胞毒性实验采用美国罗氏公司生产的乳酸脱氢酶试剂盒检测药物对心肌成纤维细胞、心肌细胞的毒性。4心肌成纤维细胞与心肌细胞共培养实验采用Corning公司生产的transwell 24孔板共培养两种细胞。成纤维细胞接种在上层培养孔中,心肌细胞接种到明胶处理的下层培养孔中,两种细胞间隔0.4gm孔径的薄膜共培养48小时。5.心肌细胞肥大测定采用3H-亮氨酸掺入实验评估心肌细胞肥大。6.Western blot、实时定量PCRWestern blot、实时定量PCR按标准步骤进行操作。采用2-ΔΔCT法测定mRNA相对水平。7.动物分组52只8周雄性C57BL/6J小鼠随进分为六组：正常对照组、GW4869注射组、DMA注射组、Ang Ⅱ注射组、Ang Ⅱ注射+GW4869注射组、Ang Ⅱ注射+DMA注射组。通过小鼠肩胛间区皮下植入渗透压微量泵注射Ang Ⅱ两周的方法诱导小鼠产生心肌肥厚,观察exosome分泌抑制剂GW4869、DMA对正常及Ang Ⅱ诱导的心肌重构小鼠体重、血压、心率、心脏重量、心肌横截面积、心肌纤维化比例以、左心室肥大及纤维化相关基因、SERCA2a表达水平的影响。8.血压和心率测量采用tail-cuff法测量尾动脉收缩伍、舒张压、平均动脉压和心率。9.组织学分析使用切片机切出厚度为5μm的石蜡切片,用于麦胚凝集素(WGA)和Masson染色以评价左室心肌组织肥大及纤维化程度。10.统计学分析数据采用平均数±标准误形式表示。数据统计采用SPSS 17.0进行,P0.05视为具有统计学差异。研究结果1.Ang Ⅱ刺激增加心肌成纤维细胞exosome分泌量Ang Ⅱ (1 μ M)能够至少使心肌成纤维细胞exosome分泌量增加43%,胰岛素(insulin,0.1 μ M)、脂多糖(LPS,0.1 μg/ml)、过氧化氢(H2O2,500 μM)等刺激因子未能改变心肌成纤维细胞的exosome分泌量。3H亮氨酸掺入实验验表明,正常培养及上述病理因子刺激的成纤维细胞分泌的exosome促进心肌细胞肥大能力没有差异。2.替米沙坦、PD123319抑制Ang Ⅱ刺激增加的心肌成纤维细胞exosome分泌量替米沙坦(10μM)、PD123319(10μ M)均能抑制Ang Ⅱ诱导的CF exosome分泌量增加,二者联用具有协同作用。3H亮氨酸掺入实验验表明,正常培养及Ang Ⅱ、替米沙坦、PD123319刺激过的成纤维细胞分泌的exosome促进心肌细胞肥大能力没有差异。3.GW4869、DMA能够抑制Ang Ⅱ联合心肌成纤维细胞共培养诱导的心肌细胞肥大GW4869 (40 μ M)、DMA (100nM)能有效地抑制CF exosome的分泌,并且对心肌细胞与心肌成纤维细胞都不具有毒性。Ang Ⅱ联合心肌成纤维细胞共培养的促心肌细胞肥大能力明显高于AngⅡ、CF共培养单种刺激因素；AngⅡ联合心肌成纤维细胞共培养的促肥大能力能够被GW4869、DMA明显抑制,并且GW4869 (40uM)、DMA (100nM)不影响AngⅡ刺激组心肌细胞的CPM值。4腹腔注射GW4869、DMA能够抑制Ang Ⅱ微量泵注射两周引起的小鼠心肌肥大经过两周Ang Ⅱ微量泵皮下注射,小鼠心肌肥大明显；GW4869、DMA腹腔注射能够显著抑制Ang Ⅱ诱导的小鼠心肌肥大,Ang Ⅱ+GW486、AngⅡ+DMA组小鼠HW/BW.左心室心肌细胞横截面积较Ang Ⅱ组明显降低。AngⅡ+GW4869、Ang Ⅱ+DMA组小鼠左心室胚胎基因ANP、BNP、βMHC mRNA表达水平较Ang Ⅱ组明显降低,a MHC mRNA表达水平较Ang Ⅱ组明显升高。5腹腔注射GW4869、DMA能够抑制Ang Ⅱ微量泵注射两周引起的小鼠心肌纤维化经过两周Ang Ⅱ微量泵皮下注射,小鼠心肌纤维化明显；GW4869、DMA腹腔注射能够显著抑制Ang Ⅱ诱导的小鼠心肌纤维化,Ang Ⅱ+GW4869、Ang Ⅱ+DMA组小鼠左心室纤维化比例以及胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、TGFβ1、CTGF mRNA表达水平较Ang Ⅱ组明显降低。6腹腔注射GW4869、DMA缓解Ang Ⅱ微量泵注射两周引起的小鼠左心室SERCA2a表达水平降低经过两周Ang Ⅱ微量泵皮下注射,小鼠左心室SERCA2a蛋白及mRNA表达水平明显降低；GW4869、DMA腹腔注射能够显著抑制Ang Ⅱ的上述效应,AngⅡ+GW4869、Ang Ⅱ+DMA组小鼠SERCA2a蛋白及mRNA表达水平较Ang Ⅱ组明显升高。研究结论1.Ang Ⅱ能够通过血管紧张素Ⅰ受体增加心肌成纤维细胞exosome分泌；2.腹腔注射exosome分泌抑制剂GW4869或者DMA能够缓解AngⅡ微量泵注射诱导的小鼠心肌肥大；3.腹腔注射exosome分泌抑制剂GW4869或者DMA能够缓解AngⅡ微量泵注射诱导的小鼠心肌纤维化；4.腹腔注射exosome分泌抑制剂GW4869或者DMA能够缓解AngⅡ微量泵注射诱导的小鼠心肌SERCA2a表达降低。总之,CF exosome作为一种旁分泌途径参与了Ang Ⅱ微量泵注射诱导的小鼠心肌重构。
【关键词】：心肌成纤维细胞 外泌体 血管紧张素-2 心肌重构 肾素-血管紧张素系统 心肌成纤维细胞 外泌体 血管紧张素-2 心肌重构 肾素-血管紧张素系统
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2
【目录】：

• 第一部分：心肌成纤维细胞来源的exosome通过激活肾素-血管紧张素系统促进心肌细胞肥大8-58
• 中文摘要8-13
• Abstract13-16
• 符号说明16-20
• 前言20-23
• 材料与方法23-35
• 研究结果35-38
• 讨论38-41
• 结论41-42
• 创新点42
• 局限性42-43
• 附图表43-55
• 参考文献55-58
• 第二部分：心肌成纤维细胞exosome作为一种旁分泌途径参与血管紧张素-2诱导的心肌重构58-101
• 中文摘要58-62
• 英文摘要62-65
• 符号说明65-68
• 前言68-70
• 材料与方法70-77
• 研究结果77-82
• 讨论82-84
• 结论84
• 创新点84-85
• 局限性85-86
• 附图86-98
• 参考文献98-101
• 英文文章1101-137
• 英文文章2137-154
• 致谢154-155
• 学位论文评阅及答辩情况表155

【参考文献】

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1 顾东风 ,黄广勇 ,吴锡桂 ,段秀芳 ,何江 ,Paul K Whelton ,Stephen Mac Mahon;中国心力衰竭流行病学调查及其患病率[J];中华心血管病杂志;2003年01期

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本文编号：639678