盐酸多奈哌齐在骨关节炎软骨细胞中抗炎机制及保护作用的研究

发布时间：2017-08-10 22:23

  本文关键词：盐酸多奈哌齐在骨关节炎软骨细胞中抗炎机制及保护作用的研究

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【摘要】：目的研究不同浓度的盐酸多奈哌齐(Donepezil)对OA患者软骨细胞生存率的影响,筛选出其最佳的药物作用浓度,观察其对TNF-α产生毒性的拮抗作用;观察最适浓度的Donepezil对TNF-α处理后的软骨细胞的基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMP)13和蛋白聚糖酶ADAMTS-5的基因表达,以及白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)前列腺素E2(PGE2)和NO分泌水平的影响;研究最佳浓度的Donepezil对TNF-α处理后的软骨细胞MAPKs信号通路(P38、ERK1/2和JNK磷酸化)的影响;研究Donepezil对TNF-α处理后的STAT1/IRF-1通路的影响;研究构建组织工程软骨,研究Donepezil对TNF-α造成的组织工程软骨的过度降解的保护作用;进一步探讨Donepezil对OA软骨降解的保护作用和可能涉及的机制。方法1.实验步骤1.1细胞培养:从OA患者行膝关节置换术的膝关节股骨髁获取软骨组织,并进行原代细胞培养和传代,获取3-5代细胞用于进行后续实验。1.2设定六个Donepezil浓度组(0、5、10、20、40、80μM),和5个TNF-α浓度组(0、2.5、5、10、20ng/ml),观察各浓度组Donepezil对软骨细胞生存的影响,然后筛选出对细胞毒性最大的TNF-α的浓度。1.3以Donepezil预处理,继而以TNF-α处理人软骨细胞,q-PCR法测定MMP-13和ADAMTS-5的mRNA表达状况,并酶联免疫吸附法测定细胞上清液中的IL-1β、IL-6、PGE2的含量,Greiss法测定细胞上清液的NO的含量。1.4以TNF-α处理人软骨细胞,以Donepezil干预,Western Blot法检测MAPKs通路(p38、ERK1/2、JNK)的磷酸化状况。1.5以TNF-α处理人软骨细胞,以Donepezil为干预,以化学制剂SB203580(p38 inhibitor),PD98059(ERK1/2 inhibitor),分别阻断p38、ERK1/2、JNK通路,ELISA检测细胞IL-1β、IL-6、PEG2的分泌情况,Greiss法测定细胞上清液的NO的含量。1.6以TNF-α处理人软骨细胞,以donepezil干预,观察其对stat1/irf-1通路的影响。1.7将软骨细胞接种在多孔纳米plla支架上,构建组织工程软骨,以TNF-α处理人软骨细胞,以donepezil干预,通过safranino染色来观察细胞支架复合物的蛋白聚糖表达情况,通过免疫组化染色和wb观察复合物中的ii型胶原,通过dmmb法测量复合物中糖胺聚糖(gag)含量,通过免疫荧光观察复合物中的软骨细胞的sox-9的表达,以此观察donepezil预防TNF-α所造成的软骨细胞基质降解的情况。结果1.1donepezil对软骨细胞活力的影响实验结果显示:20μm以下的donepezil对细胞的活力无任何影响(p0.05,与对照组相比较)。40、80μm浓度组对细胞生长有抑制作用(p0.05,与对照组细胞比较)。而TNF-α浓度组(0、2.5、5、10、20ng/ml)中,10ng/ml的TNF-α对细胞活性抑制的最为明显。和单纯TNF-α处理组比较,以donepezil干预可大大提高细胞的活性(p0.05)。1.2donepezil对TNF-α诱导的软骨细胞的mmp-13mrna和adamts-5的影响。软骨细胞以10、20μmdonepezil预处理24h再加入10ng/ml的TNF-α收集细胞行q-pcr。单纯TNF-α处理组相比,donepezil组的mmp-13mrna和adamts-5表达水平明显降低。1.3donepezil对TNF-α诱导的软骨细胞上清液中的il-1β、il-6、pge2和no的分泌的影响。软骨细胞以10、20μmdonepezil预处理24h加入10ng/ml的TNF-α,刺激72h收集细胞上清液行elisa检测和greiss检测。结果显示,与TNF-α处理组相比,donepezil可使TNF-α诱导产生的il-1β、il-6、pge2和no的分泌显著性下降。1.4donepezil对TNF-α诱导的软骨细胞的stat1/irf、p-p38、p-erk1/2和p-jnk表达的影响。TNF-α诱导组的p38、erk1/2和jnk的磷酸化明显增加。而经donepezil干预后,p38和erk1/2的通路的磷酸化明显受到抑制,而donepezil对jnk通路的磷酸化并没有影响。1.5donepezil以及mapks(erk,p38)通路抑制剂对il-1β、il-6、pge2和no的影响。1.6免疫荧光显示,TNF-α的刺激会引起irf-1因子的表达,irf-1的sirna可,而donepezil的干预可以抑制stat1因子的上调,进而抑制irf-1通路的激活。irf-1的上调可特异性的引起MMP-13的表达,而Donepezil可特异性的削弱由IRF-1上调引起的MMP-13的表达。1.7 Donepezil对TNF-a导致的组织工程软骨复合物基质降解的保护作用免疫组化结果显示,Donepezil干预组复合物比单纯TNF-α处理组的II型胶原特异性染色更强。Safranin O染色提示Donepezil干预组的蛋白多聚糖的积累多于单纯TNF-α处理组。且DMMB法测的Donepezil干预组的糖胺聚糖(GAG)同样多于单纯TNF-α处理组(P0.01)。经过Donepezil干预后的软骨支架复合物的SOX-9的表达明显多于单纯TNF-α处理组。结论1.10、20μM浓度的Donepezil对细胞的生长无影响,可作为后续实验的干预浓度,10ng/mL的TNF-α对软骨细胞的毒性最大,可作为后续实验的负性处理因素,且Donepezil的干预可以逆转TNF-α造成的软骨细胞的活力下降。2.Donepezil可以显著的下调由TNF-α诱导产生的MMP-13和ADAMTS-5的mRNA的表达。3.Donepezil可以显著的下调由TNF-α诱导产生的IL-1β、IL-6、PGE2和NO的分泌增加。4.Donepezil可以抑制TNF-α导致的MAPK-p38和ERK1/2的磷酸化。但是对TNF-α引起的JNK通路的活化没有任何作用。5.和其它信号通路抑制剂相比,Donepezil可以抑制的由TNF-α诱导产生的炎性因子较为广泛,这可能与Donepezil参与多信号通路抑制调控,通过多靶点抑制炎症发展有关。6.TNF-α可以通过激活STAT1途径提高IRF-1的表达,进而上调MMP-13的分泌,而这一通路可被Donepezil抑制。7.Donepezil可以抑制TNF-α导致的细胞基质的降解。
【关键词】：盐酸多奈哌齐 TNF-α 基质金属蛋白酶 抗炎 骨关节炎
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R684.3
【目录】：

• 英文缩写一览表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-17
• 1.1 研究背景14-16
• 1.2 课题设计思路与技术路线16-17
• 第二章 软骨细胞的培养和Donepezil对软骨细胞的保护作用17-24
• 2.1 实验目的17
• 2.2 实验材料17-18
• 2.3 实验方法18-20
• 2.4 实验结果20-22
• 2.5 讨论22-23
• 2.6 小结23-24
• 第三章 Donepezil对TNF-α 诱导的OA软骨细胞的保护作用24-38
• 3.1 实验目的24
• 3.2 实验材料24-26
• 3.3 实验方法26-32
• 3.4 结果32-36
• 3.5 讨论36-37
• 3.6 小结37-38
• 第四章 Donepezil对软骨细胞的抗炎保护作用的机制研究38-54
• 4.1 实验目的38
• 4.2 实验材料38-44
• 4.3 实验方法44-50
• 4.4 结果50-51
• 4.5 讨论51-53
• 4.6 小结53-54
• 第五章 Donepezil可抑制由TNF-α 介导的干扰素调节因子-1（IRF-1）54-65
• 5.1 实验目的54
• 5.2 实验材料54-56
• 5.3 实验方法56-60
• 5.4 结果60-64
• 5.5 讨论64
• 5.6 小结64-65
• 第六章 Donepezil对TNF-α 诱导的OA软骨细胞基质降解的保护作用65-80
• 6.1 实验目的65
• 6.2 实验材料65-71
• 6.3 实验方法71-76
• 6.4 结果76-78
• 6.5 讨论78-79
• 6.6 小结79-80
• 全文结论80-81
• 参考文献81-84
• 文献综述一 骨关节炎的发病机制与治疗进展84-94
• 参考文献88-94
• 文献综述二 骨关节炎的药物治疗94-100
• 参考文献98-100
• 在读期间发表论文情况100-101
• 致谢101

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 马春辉;阎作勤;郭常安;张光健;;凋亡相关基因Bax和bcl-2在骨关节炎软骨中的作用[J];中华关节外科杂志(电子版);2007年04期

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本文编号：653005