急性脊髓损伤的生物信息学分析及相关基因HIF-1α的表达分析
发布时间：2017-08-13 13:06
本文关键词：急性脊髓损伤的生物信息学分析及相关基因HIF-1α的表达分析
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【摘要】：研究背景：脊髓损伤(SCI)一般情况下定义为脊椎脊髓受到伤害而造成其主要功能包括运动,感觉,自主神经和反射等功能的完全或者部分的丧失,是临床上一种常见的严重的致残性损伤,给家庭和社会带来沉重的负担。脊髓损伤的病理生理过程的研究对促进其综合性药物干预措施的研究至关重要。继发于脊髓原发损伤的继发性损伤所产生的损害远远超过了原发性损伤,是发生于细胞和分子水平的一个主动调节过程,是可以受调控因素影响的,所以这个过程具有可逆性且可被控制。目前对于SC1的研究主要集中在脊髓损伤后基因表达的变化方面。基因芯片(gene chip)又可以称之为DNA微阵列(DNA microarray),这项技术是伴随着人类基因组计划而产生的,他是目前生命科学领域当中的前沿性生物技术之一。基因芯片显著的特点是它所具有的高通量、高集成、多样化、微型化以及自动化等相关特性。经过最近特别是近十几年的发展,基因芯片已经在相关的研究中的基因表达分析、疾病的基因诊断、药物的基因组学等诸多领域发挥着越来越重要的作用,并且在未来的相关生物研究中中具有巨大的研究和应用前景。集合了多种mRNA表达谱的基因芯片可以筛选大鼠脊髓损伤后脊髓内的差异表达基因。通过筛选出的相关基因可以很方便、快速地了解和认识疾病的发生和发展过程,为疾病诊断的确定和提供恰当的治疗方案提供有力生物医学技术的保证。现在脊髓损伤的动物模型有多种,例如球囊压迫,挤压,钳夹,侧切,全切,脊椎横断,挫伤和去除一部份脊髓组织。为更好的模拟脊髓损伤的原发和继发的损伤过程,我们采用大鼠钳夹实验模型,应用血管夹(vascular clip)损伤脊髓组织,对脊髓组织进行挤压但是保持硬脊膜的完整性。所建立的动物模型具有简单、廉价并且高度可重复性。缺血(ischemia)越来越多的被认为是急性脊髓损伤的病理生理变化的一个焦点,它可能是引起和加重急性脊髓损伤继发性损伤的重要原因。低氧诱导因子是迄今发现的组织细胞在低氧状态下诱生的最直接或唯一的调控因子,是调节低氧状态下细胞分化和存活的关键性调节因子。在相关的脊髓损伤的生物信息学分析中我们发现HIF-1可能是脊髓损伤中的关键性调节因子。我们通过自己建立的改良大鼠脊髓损伤动物模型,应用RT-PCR,Western blot,原位杂交,ELISA等检测方法,检测损伤后不同时间点HIF-1及其靶基因VEG、EPO的表达并分析它们与脊髓损伤的相关性和相互之间的相关性。同时,结合临床检测脊髓损伤患者外周血中的VEG、EPO的表达情况,与动物实验结果对比研究,探讨HIF-1及其靶基因VEG, EPO在继发性脊髓损伤发生发展过程中作用,从而为临床治疗脊髓损伤提供理论依据。目的：1.本实验的目的为使用集合了多种mRNA表达谱的基因芯片来筛选大鼠脊髓损伤后脊髓内的差异表达基因,及脊髓损伤后差异表达的上调基因和下调基因。2.建立一种改良大鼠脊髓损伤模型,并评价其可重复性及可操作性；3.探究低氧诱导因子及其靶基因在脊髓损伤后的缺氧耐受及血管新生相关的病理生理过程中的表达。方法：1.1选择NCBI基因表达数据库的基因芯片数据(Gene Expression Omnibus,GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).选取GSE2270基因芯片表达数据。1.2使用R语言的limma数据包,通过与相应的对照组对比,确定脊髓损伤后的差异表达基因(DEGs)。1.3采用Cytoscape软件及其插件对DEGs进行GO富集分析。1.4 使用DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, http://www.david.niaid.nih.gov)网络工具,通过超几何分布法,对差异表达基因(DEGs)进行通路功能富集分析,计算在通路中的P值。所得数据与KEGG通路数据库进行匹配。1.5使用DiRE数据库分析富集在细胞通路上的DEGs,寻找每一个细胞通路上的调控元件。2.采用钳夹法建立大鼠急性脊髓损伤实验模型。采用神经行为学评价BBB评分体系评价模型的神经功能,采用HE染色和尼氏染色评价脊髓损伤脊髓的病理变化。3.1通过RT-PCR方法检测脊髓损伤后不同时相HIF-1α mRNA的变化。3.2原位杂交及免疫组化方法分析脊髓损伤后不同时相脊髓组织内HIF-1α mRNA和蛋白的表达情况。3.3采用Western blot及TU N EL染色方法分析不同时相AI F和Caspase-3蛋白的表达水平,观察脊髓内神经细胞凋亡情况。3.4采用ELISA方法检测临床脊髓损伤患者外周血内VEGF EPO的表达情况。结果：1.通过生物信息学分析,共确定了173个差异表达基因(DEGs),其中130个上调基因,43个下调基因。这些DEGs富集于不同的GO,如损伤应答、炎症应答和免疫应答等。通过DEGs的通路富集分析,8条通路被显著富集,如细胞外基质(ECM)受体相互作用通路,Toll样受体(TLR)信号通路等。在每一条通路中,都有显著的调控元件和调控因子,其中缺氧诱导因子、同源框蛋白BEL1是两个含量最高的调控因子,RAC2是处于焦点位置的调控因子。通过分析确定了几个关键基因,HIF1, BAC2, CD44, 和ARPC1B,它们都通过不同的通路参与SCI疾病的进展。2.钳夹大鼠急性脊髓损伤实验模型的建立,实验组的BBB评分同对照组相比,各组间差异具有统计学意义(p0.05)。对照组HE和尼氏染色基本正常,实验组显示随着缺血时间延长,脊髓病理学变化逐渐加重,脊髓灰质前角神经元更明显,主要表现为神经元尼氏体淡染或消失。3.1 RT-PCR检测发现,正常的脊髓中HIF-1α保持在较低水平；脊髓损伤后6-72小时,HIF-1α的表达明增加；1周后,其表达开始下降。HIF-1α mRNA的表达是与脊髓损伤后缺血程度相互平行,尤其是在伤后2-3天HIF-1α的表达达到峰值。3.2损伤脊髓组织原位杂交显示：几乎所有的损伤区域神经元细胞都表达HIF-α mRNA的,而在正常的脊髓表达非常弱。3.3免疫组化显示损伤脊髓内HIF。1α蛋白的表达明显增加,其趋势和HIF-1α mRNA的表达基本一致,但是蛋白的表达要比mRNA的表达要早。VEGF、EPO在正常脊髓组织中表达呈现一个低水平,在脊髓损伤的大鼠模型中损伤后的24小时表达开始增加,48-72小时中达到峰值并且逐渐下降。3.4应用Western blots印迹技术检测对照组和实验组大鼠的脊髓的AIF和caspase-3蛋白的表达水平。伤后6小时组AIF、caspase-3蛋白的表达显著增加,3 d时达高峰,7 d凋亡相关基因表达逐日减少。TUNEL染色检测各组脊髓神经细胞凋亡情况。对照组手术组中只观察到少数TUNEL阳性细胞。然而,在损伤后6小时组、12小时、24小时组观察到具有高荧光信号的较多TUNEL阳性细胞,3d时凋亡细胞量最多,7d开始减少。3.5脊髓损伤患者外周血ELISA法检测HIF-1α调控下游基因VEGF、EPO在外周血的表达明显的升高,与正常人外周血比较差异有明显的统计学意义。结论：1.经基因本体及其富集的通路研究发现,SCI主要与炎症和免疫有关。CD44可能是脊髓损伤进展过程中免疫应答的刺激因子。在脊髓损伤发病机制中RAC2与HIF1有明显的相互作用,并起关键调节作用。ARPC1B在调节细胞骨架和活性中起基础性作用。2.经过我们改良的脊髓损伤模型可以模拟不同程度的脊髓损伤,并且可靠、简单具有高度重复性,病理改变稳定。3.研究表明在脊髓损伤后,HIF-1a通过增加蛋白的稳定性和上调转录活性,其蛋白表达增加。随着HIF-1a表达的上调其相应的靶基因EPO和VEGF也随之表达增加。结合病理过程发现HIF-1a表达上调可能参与了脊髓损伤后的低氧耐受、细胞凋亡和血管微环境的重建。4.我们的研究证实在急性损伤后脊髓细胞可能通过细胞凋亡造成脊髓组织的损害,这可能和临床上相关的神经症状后遗症相关。但是脊髓组织可以通过自身的的HIF-1 Q及其靶基因等的时序性表达以帮助脊髓组织度过这种损伤的环境。
【关键词】：脊髓损伤 生物信息学分析 低氧诱导因子 动物模型 表达方式
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2
【目录】：
- 中文摘要8-12
- 英文摘要12-17
- 符号说明17-18
- 第一部分 大鼠急性脊髓损伤中的表达谱及生物信息学分析18-30
- 前言18-19
- 1.1 实验目的19-20
- 1.2 材料与方法20-21
- 1.3 结果21-22
- 1.4 讨论22-26
- 1.5 结论26-27
- 1.6 附图表27-30
- 第二部分 改良大鼠急性脊髓损伤模型的再评价及应用研究30-42
- 前言30
- 2.1 资料和方法30-34
- 2.2 结果34-35
- 2.3 讨论35-39
- 2.4 附图表39-42
- 第三部分 HIF-1α及其相关基因在大鼠急性脊髓损伤和临床SCI患者外周血中的实验研究42-66
- 3.1 资料与方法43-54
- 3.2 结果54-56
- 3.3 讨论56-61
- 3.4 结论61-62
- 3.5 附图表62-66
- 参考文献66-76
- 致谢76-77
- 攻读博士期间发表的论文77-78
- 外文论文Ⅰ78-92
- 外文论文Ⅱ92-106
- 论文评阅及答辨情况表106
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 卢e，
本文编号：667414
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/667414.html
教材专著
