铜配合物的合成、晶体结构及抑制肿瘤血管生成的研究

发布时间：2017-08-16 23:25

  本文关键词：铜配合物的合成、晶体结构及抑制肿瘤血管生成的研究

  更多相关文章： 席夫碱铜配合物 晶体结构 抗血管生成 抗肿瘤 siRNA 载体

【摘要】：肿瘤的发生、浸润、恶化和转移与新血管生成密切相关。靶向抑制肿瘤血管生成是一种重要的肿瘤治疗手段,目前已经从化学治疗快速进入到运用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术进行基因治疗。铜配合物药物被认为是铂类抗肿瘤药物的替代。研究表明,铜基配合物可应用于基因载体,在生物医学上的应用有了较大的发展。抑制肿瘤血管生成的铜配合物研究非常少,以肿瘤血管和VEGF为靶点,以肿瘤细胞和血管内皮为重要靶细胞,多视野研究铜基配合物的抗肿瘤活性具有非常大的新颖性和重要的意义。基于上述研究背景,本论文中合成了三种不同类型的新颖的希夫碱类铜配合物和一种二肽类铜配合物,获得了它们的单晶结构。靶向抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制VEGF的表达,从多个角度研究它们抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤的性质及其机理,研究细胞吸收及吸收机制。更重要的是,成功地构建了手性纳米铜基配合物单晶负载si RNA体系,将靶向抑制肿瘤血管生成的VEGF-si RNA成功递送到靶细胞的细胞质。考察了纳米铜基配合物si RNA负载体系抑制肿瘤血管生成的功能及其机理,最终获得了新型的纳米级铜基配合物si RNA载体,将载体的化学治疗与si RNA的沉默效应联合,增强了抑制血管生成和抗肿瘤的功效。本论文主要包括以下五章与结论:第一章,主要综述了抑制血管生成和抗肿瘤作用研究的重要靶点、抑制血管生成和抗肿瘤作用的机理、铜基配合物抗肿瘤活性的研究进展以及抗血管药物的研究进展,介绍了MOFs作为载体,载药与负载si RNA在抗肿瘤方面的应用与局限。基于这些研究背景,我们提出了本论文研究的选题目的与意义、研究的内容以及探讨的问题。第二章,合成了两个以4,4'-联吡啶桥连的双核铜配合物(Cu-1和Cu-2),并获得单晶,表征了晶体结构;用MTT法检测了它们的细胞毒性,用流式细胞分析法检测了诱导细胞凋亡的效果;以HUVECs细胞迁移和管形成实验以及鸡绒毛膜尿囊血管生成模型考察了它们对VEGF介导的细胞迁移和血管生成的影响效果;结合流式细胞分析法和激光光聚焦显微镜活细胞成像,研究了Cu-2的细胞吸收及细胞吸收机理;用Western Blot考察了它们对Akt/p-Akt和Erk1/2/p-Erk1/2信号分子的影响;结合流式细胞分析法和激光光聚焦显微镜活细胞成像,研究了它们对细胞内活性氧的影响。实验结果表明,Cu-2比Cu-1更有效地抑制血管生成和抗肿瘤作用,它能以能量依赖非内吞方式进入肿瘤细胞和血管内皮细胞的细胞核,抑制p-Akt和p-Erk1/2蛋白的表达,下调活性氧水平,显著地抑制血管生成和诱导细胞凋亡,是潜在的肿瘤血管生成抑制剂和抗肿瘤药物。第三章,合成了一个有荧光的混配的单核铜基配合物(PSBCu),并获得单晶,表征了晶体结构。采用与第二章相同的研究方法考察了PSBCu的细胞吸收、抑制血管生成与抗肿瘤的性质以及机理。此外,用荧光光谱与CD光谱研究了PSBCu与人血清白蛋白(HSA)的结合作用。研究了PSBCu诱导VEGF DNA形成G4-联体结构以及稳定G4-联体结构的能力。结果表明,PSBCu能被肿瘤细胞与血管内皮细胞吸收,下调p-Akt和p-Erk1/2蛋白分子的表达,增加细胞内活性氧水平,有效地抑制了肿瘤细胞和血管内皮细胞的增值、促进诱导凋亡,抑制了肿瘤血管生成,增强抗肿瘤作用。此外,它能诱导VEGF DNA形成G4-联体结构并稳定它们的结构,可能在转录水平上抑制VEGF的表达,更有效地抑制了肿瘤血管生成。PSBCu可能是一个多功能的肿瘤血管生成抑制剂和抗肿瘤药物。第四章,合成了一对手性的水溶性的四核铜基配合物,并获得了六角边-板状体单晶(L-Cu和D-Cu),表征了晶体结构。引人注目的是,只需要在适当的溶剂中溶解晶体,纳米级单晶就可以制得。重要的是,用纳米单晶构建了一个si RNA负载体系。琼脂糖凝胶电泳、高倍投射电镜、细胞吸收、转染实验等表明了L-Cu和D-Cu能负载和释放si RNA到靶细胞的细胞质。用管形成实验、鸡绒毛膜尿膜囊以及鼠动脉环血管生成模型研究了它们对VEGF介导的血管生成的抑制效果。从VEGF/VEGFR2信号转导通路、活性氧、线粒体跨膜电位的角度分析它们抑制血管生成和抗肿瘤的机理。所有研究结果表明,这对纳米级铜配合物可负载VEGF-si RNA,而且L-Cu比D-Cu有更好的装载效率;保护VEGF-si RNA免遭核酸酶降解,增强了VEGF-si RNA的细胞吸收,促进了VEGF-si RNA从溶酶体中逃逸,沉默VEGF基因的表达,激活了Erk/p-Erk1/2,Akt/p-Akt和FAK/p-FAK信号通道,增强了抑制血管生成和抗肿瘤的功效。这项工作还表明,该铜基配合物能将化疗功能与基因治疗功能结合,增强了抗肿瘤的效果,有远大的应用前景,既是优良的肿瘤血管生成抑制剂和抗肿瘤药物的候选,又是良好的非病毒基因载体,第五章,合成了另一对新颖的手性的四核铜配合物(L-TNBr Cu和D-TNBr Cu),并获得了块状单晶,表征了晶体结构。用流式细胞分析法检测了细胞凋亡、活性氧、线粒体跨膜电位的影响,用Western Blot考察了它们对与血管生成密切相关的VEGF/VEGFR2信号转导通路中三条重要信号通道的影响。结果表明,手性的L-TNBr Cu和D-TNBr Cu对肿瘤细胞都具有广普的细胞毒性,而且对肿瘤细胞的毒性没有显著的手性差异,抗肿瘤功能可以通过同时靶向肿瘤细胞和血管内皮细胞,调控细胞内ROS水平,降低线粒体膜电位,下调p-AKT、p-Erk1/2和p-FAK的表达,抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的增殖与转移、诱导细胞凋亡。它们也是潜在的抗肿瘤药物。结论部分,总结了四种铜基配合物抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤的性质及其作用机理的相似之处和差异,阐明了不同配体、不同配位数、不同几何构型的铜基配合物的生物活性之间的密切联系与差异。展望了席夫碱铜基配合物作为新型多功能肿瘤血管生成抑制剂和抗肿瘤药物以及作为基因载体的潜在前景。
【关键词】：席夫碱铜配合物 晶体结构 抗血管生成 抗肿瘤 siRNA 载体
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914;O641.4
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-15
• 第一章 绪论15-44
• 1.1 抗肿瘤作用的重要靶点.15-19
• 1.1.1 VEGF作为抑制血管生成与抗肿瘤的重要靶点15-18
• 1.1.2 肿瘤细胞和血管内皮细胞是重要的靶细胞18-19
• 1.2 抗肿瘤的机理研究19-20
• 1.2.1 VEGF/VEGFR2介导的重要信号通道19-20
• 1.2.2 活性氧20
• 1.2.3 线粒体跨膜电位20
• 1.3 铜基配合物抗肿瘤活性的研究进展20-28
• 1.3.1 铜基配合物抗肿瘤研究21-26
• 1.3.2 铜与血管生成26-28
• 1.4 抗血管药物的研究进展28-29
• 1.5 本博士论文选题目的与意义29-30
• 参考文献30-44
• 第二章 两个双核铜配合物的合成、晶体结构及抗肿瘤活性的研究44-77
• 2.1 引言44-45
• 2.2 实验试剂与实验仪器45-46
• 2.2.1 主要的实验试剂和材料46
• 2.2.2 主要的实验仪器46
• 2.3 实验部分46-55
• 2.3.1 双核铜基配合物Cu-1的合成46-47
• 2.3.2 双核铜基配合物Cu-2的合成47
• 2.3.3 配合物Cu-1和-Cu-2单晶结构的测定及解析47-48
• 2.3.4 细胞毒性实验48-49
• 2.3.5 凋亡分析实验49
• 2.3.6 HUVECs迁移实验49
• 2.3.7 HUVECs管形成实验49-50
• 2.3.8 鸡胚绒毛尿膜囊实验50
• 2.3.9 细胞吸收和细胞吸收机理50-51
• 2.3.10 Western Blot实验51-54
• 2.3.11 细胞内活性氧测定54-55
• 2.4 结果与讨论55-68
• 2.4.1 配合物Cu-1和Cu-2的红外光谱分析55
• 2.4.2 配合物Cu-1和Cu-2的单晶结构分析55-61
• 2.4.3 细胞毒性分析61-63
• 2.4.4 诱导凋亡分析63
• 2.4.5 抑制血管生成分析63-64
• 2.4.6 细胞吸收及机理分析64-66
• 2.4.7 Western Blot分析66-67
• 2.4.8 活性氧影响分析67-68
• 2.5 本章小结68-69
• 参考文献69-71
• Supplementary Figures71-77
• 第三章 一个混配单核铜配合物的合成、晶体结构及抗肿瘤活性研究77-104
• 3.1 引言77
• 3.2 实验试剂与实验仪器77-78
• 3.2.1 主要的实验试剂和材料77-78
• 3.2.2 主要的实验仪器78
• 3.3 实验部分78-82
• 3.3.1 配合物PSBCu的合成、元素分析和红外表征78-79
• 3.3.2 配合物PSBCu单晶结构的测定及解析79
• 3.3.3 细胞毒性实验79-80
• 3.3.4 凋亡分析实验80
• 3.3.5 HUVECs迁移实验80
• 3.3.6 HUVECs管形成实验80
• 3.3.7 鸡胚绒毛尿膜囊实验80
• 3.3.8 PSBCu的细胞吸收80-81
• 3.3.9 Western Blot实验81
• 3.3.10 细胞内活性氧测定81
• 3.3.11 荧光光谱测定81-82
• 3.3.12 CD光谱测定82
• 3.4 结果与讨论82-95
• 3.4.1 PSBCu的单晶结构分析82-86
• 3.4.2 体外细胞毒性分析86-87
• 3.4.3 诱导凋亡分析87-88
• 3.4.4 抑制血管生成分析88-89
• 3.4.5 细胞吸收分析89-90
• 3.4.6 Western Blot分析90-91
• 3.4.7 活性氧影响分析91-92
• 3.4.8 HSA与PSBCu作用的荧光光谱和CD光谱分析92-94
• 3.4.9 VEGF与PSBCu作用的CD光谱分析94-95
• 3.5 本章小结95-96
• 参考文献96-98
• Supplementary Figures98-104
• 第四章 纳米级手性四核铜配合物负载VEGF-siRNA抑制肿瘤血管生成及其信号通路的研究104-146
• 4.1 引言104-105
• 4.2 实验试剂与实验仪器105-106
• 4.2.1 主要的实验试剂和材料105-106
• 4.2.2 主要的实验仪器106
• 4.3 实验部分106-116
• 4.3.1 配体L/D-SB的合成及红外光谱测定106-107
• 4.3.2 配合物L/D-Cu单晶的合成、单晶的培养、红外光谱测定107-108
• 4.3.3 扫描电镜观察L/D-Cu单晶的形貌108
• 4.3.4 配合物L/D-Cu单晶绝对构型的测定及解析108-109
• 4.3.5 L/D-Cu单晶纳米级、微粒级混合粒子的制备109-110
• 4.3.6 纳米复合物L-Cu/siRNA的制备110
• 4.3.7 VEGF-siRNA琼脂糖凝胶电泳110-112
• 4.3.8 绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)琼脂糖凝胶电泳112
• 4.3.9 流式分析L/D-Cu/siRNA的体外细胞吸收112-113
• 4.3.10 siRNA的体外细胞吸收及释放113-114
• 4.4.11 pEGFP转染114
• 4.3.12 细胞毒性实验114-115
• 4.3.13 细胞凋亡实验115
• 4.3.14 HUVECs细胞管形成实验115
• 4.3.15 鸡胚实验115
• 4.3.16 鼠动脉环实验115
• 4.3.17 Western Blot115
• 4.3.18 活性氧实验115-116
• 4.3.19 线粒体膜电位实验116
• 4.4 结果与讨论116-137
• 4.4.1 L-Cu和D-Cu的单晶形貌116
• 4.4.2 L-Cu和D-Cu单晶的晶体结构116-122
• 4.4.3 L-Cu和D-Cu纳米粒子和纳米单晶122-124
• 4.4.4 D/L-Cu纳米颗粒负载VEGF-siRNA124-126
• 4.4.5 VEGF-siRNA琼脂糖凝胶电泳126-128
• 4.4.6 pEGFP琼脂糖凝胶电泳128
• 4.4.7 L-Cu/siRNA~(FAM)和D-Cu/siRNA~(FAM)的细胞吸收及定位128-130
• 4.4.8 pEGFP转染结果130-131
• 4.4.9 细胞毒性131-132
• 4.4.10 诱导细胞凋亡132
• 4.4.11 抑制VEGF诱导的管形成132-133
• 4.4.12 抑制鸡绒毛尿膜囊血管生成133
• 4.4.13 抑制鼠动脉微管的生成133-134
• 4.4.14 Western Blot的分析134-135
• 4.4.15 活性氧分析135-136
• 4.4.16 线粒体跨膜电位136-137
• 4.5 本章小结137-138
• 参考文献138-142
• Supplementary Figures142-146
• 第五章 手性四核铜配合物的合成、晶体结构及靶向肿瘤细胞和血管内皮细胞的研究146-166
• 5.1 引言146-147
• 5.2 实验试剂与实验仪器147
• 5.2.1 主要的实验试剂和材料147
• 5.2.2 主要的实验仪器147
• 5.3 实验部分147-153
• 5.3.1 配体L/D-SB的合成及红外光谱测定147-149
• 5.3.2 配合物L/D-TNBrCu单晶的合成及单晶的培养149-150
• 5.3.3 CD光谱表征晶体的绝对构型150
• 5.3.4 配合物L/D-TNBrCu单晶绝对构型的测定及解析150-151
• 5.3.5 细胞毒性实验151-152
• 5.3.6 流式细胞分析仪Annexin V/PI双染法测凋亡152
• 5.3.7 ROS测定152
• 5.3.8 线粒体膜电位测定152-153
• 5.3.9 Western Blot实验153
• 5.4 结果与讨论153-163
• 5.4.1 L-TNBrCu和D-TNBrCu的CD光谱结果153
• 5.4.2 配合物L/D-TNBrCu的晶体结构153-159
• 5.4.3 细胞毒性分析159
• 5.4.4 诱导细胞凋亡159-160
• 5.4.5 细胞内ROS分析160
• 5.4.6 JC-1分析160-162
• 5.4.7 Western Blot分析162-163
• 5.5 本章小结163-164
• 参考文献164-166
• 结论与展望166-168
• 博士期间发表的论文168-170
• 致谢170

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