RIP3硝化在大鼠心脑缺血再灌注损伤中的作用及红花黄色素的干预研究

发布时间：2017-08-20 12:21

  本文关键词：RIP3硝化在大鼠心脑缺血再灌注损伤中的作用及红花黄色素的干预研究

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【摘要】：研究背景缺血性心脏疾病和脑卒中通过介入或者药物溶栓等方法实现血运重建是心脑的重要措施,也极大地改善了患者的预后,但是由此导致的缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury, IRI),在一定程度上削弱了介入或者药物溶栓在临床上的应用效果。IRI现象的发现迫使人们开始心脑保护的相关基础和临床研究。缺血再灌注损伤涉及到诸多环节,包能量代谢障碍、钙超载、氧自由基损伤和细胞凋亡等。如何抑制细胞凋亡进而减轻或避免IRI,寻求减轻IRI的靶点,探索其分子机制,找到新的心脑保护药物和策略,成为研究的热点问题。一氧化氮(Nitric oxide, NO)参与了众多疾病的生理和病理生理过程,是一种易扩散的生物活性小分子,在调控氧化还原信号和细胞功能中具有重要作用。激活依赖环鸟苷酸(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)信号通路是NO的经典途径,进而调节机体的生理作用；NO还可以通过与蛋白质亲核巯基发生翻译后修饰进一步生成亚硝基硫醇(S-nitrosothiols, RSNO)达到修饰调节细胞功能的目的,因此研究蛋白质巯基亚硝基化及其相关信号转导机制将为临床提供新的减轻IRI的干预手段和方法。在缺血缺氧等氧化应激条件下,体内会过量生成NO与O2-,短时间内瀑布样反应生成大量过氧亚硝基阴离子ONOO",作用于细胞内靶蛋白质酪氨酸等残基,使其发生硝化,起到调节蛋白质功能的作用。硝化过多的现象见于多种疾病的病理损伤过程,如心血管疾病、部分炎症、缺血性脑血管疾病和退行性神经病变等。蛋白质硝化是指由NO自由基与02-迅速反应,在短时间内生成大量ONOO-,对细胞内蛋白质中的酪氨酸残基进行硝化生成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT),从而改变其结构和功能。RIP3(Receptor interacting protein3,RIP3)作为细胞应激传感分子,在调控细胞凋亡、细胞坏死通路中发挥重要作用,那么RIP3的硝化在IRI的是如何变化的呢?该硝化在整个调控过程中扮演何种角色,以及作用的靶点在什么地方都是需要进行研究的。减轻缺血再灌注损伤的手段和药物较多,其中传统中医药具有很大优势,而红花黄色素(safflor yellow, SY)具有清除自由基、改善心脑细胞能量代谢、减轻钙超载、抑制细胞凋亡等多种作用,可减轻IRI。但其作用的分子机制是否在抑制硝化中发挥重要作用呢?我们通过动物在体和器官离体实验,应用生物化学与分子生物学技术和形态学手段进行了相关检测和系列研究。第一部分：RIP3硝化对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及红花黄色素干预研究研究背景缺血再灌注损伤(ischemia and reperfusion injury, IRI)是指组织因缺血发生可逆性、可存活的损伤,缺血区域再次获得血运重建后原来功能障碍和结构损伤却进一步加重的现象。缺血性心脏病在恢复再灌注后,部分可发生再灌注心律失常、心肌舒缩功能障碍、代谢异常及心肌超微结构的改变,其中氧自由基(oxygen free radicals,OFR)的过量产生是导致心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)的重要因素之一。在缺血缺氧后体内会过量生成NO与O2-,短时间内迅速反应生成大量过氧亚硝基阴离子(ONOO-),作用于细胞内靶蛋白质酪氨酸等残基,使其发生硝化,调节蛋白质的功能。硝化过多则参与介导各种缺血性心脑损伤、炎症和退行性神经病变等多种疾病的病理过程。受体相互作用蛋白3(Receptor interacting protein 3, RIP3)作为最早被鉴定出来的蛋白激酶之一,属于RIPs家族的一员,其过量表达导致细胞凋亡。多种缺血坏死性疾病有RIP3的参与,但RIP3及其共价修饰(硝化)在MIRI中的研究较少,尤其是应用分子生物学的技术和手段以及通过在体心肌缺血再灌注(Ischemia-reperfusion, I/R)模型研究,尚无相关的报道。红花黄色素(safflor yellow,SY)可以抑制自由基产生或清除自由基、改善心肌组织能量代谢、减轻细胞内钙超载和抑制细胞凋亡等多种作用,从而减轻MIRI。但SY保护MIRI的内在机制,尤其是分子信号通路研究报道极少,‘是目前亟待解决的问题。在此基础上,我们提出：1.RIP3硝化在MIRI中是否发挥重要重要作用?2.中药红花黄色素的,心肌保护作用是否与RIP3硝化及RIP1磷酸化(活化)等具有相关性。研究目的1.观察SY后处理在体缺血再灌注大鼠心肌的血流动力学、组织病理学的变化情况。2.给予不同剂量SY进行干预后处理,检测RIP3硝化(nitration of receptor interacting protein 3, N-RIP3)及RIP1磷酸化(phosphorylation of receptor interacting protein 1,P-RIP1),研究SY对在体大鼠MIRI保护作用的分子机制。研究方法1.清洁级健康SD大鼠108只,雄性,随机分为6组(n=18)：假手术组(Sham组)、心肌缺血再灌注组(I/R组)、SY低剂量组(SY 10 mg/kg组)、SY中剂量组(SY 30 mg/kg组)、SY高剂量组(SY 90 mg/kg组)、依达拉奉组(Eda 10 mg/kg组)。通过在体夹闭冠状动脉左前降支(left anterior descending of coronary artery, LAD)的方法制备MIRI模型。Sham组只穿缝线,不结扎。I/R组及药物干预各组在再灌注前1 min经分别经股静脉注射0.9%氯化钠注射液、不同剂量SY和Eda, SY及Eda均用等量0.9%氯化钠注射液稀释；Sham组在对应时间点注射等量0.9%氯化钠注射液。2.在缺血即刻(To)、缺血30 min末(T1)、再灌注30 min末(T2)、再灌注60 min末(T3)、再灌注90 min末(T4)和再灌注120 min末(T5)等6个时间点记录大鼠心肌功能学指标：心率(HR)、左室发展压(left ventricular development pressure, LVDP)、左室舒张末期压(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、左室内压上升和下降速率最大值(maximum change rate of left ventricular pressure rise and fall,±dp/dtmax)。3.再灌注120 min末穿刺右心室抽取静脉血,采用比色法测血浆中丙二醛(malonaldehyde, MDA)的含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme MB, CK-MB)的活性；4.实验结束处死动物,取心脏切片后给予2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride, TTC)染色计算心肌梗死面积(%),HE染色观察心肌组织学改变,Western Blot法测定硝化的受体相互作用蛋白3(nitration of receptor interacting protein 3, N-RIP3)、磷酸化的受体相互作用蛋白1(phosphorylation of receptor interacting protein 1, P-RIP1)的水平。研究结果1.各组缺血前血流动力学指标HR, LVEDP、LVDP、±dp/dtmax相比较,差异无统计学意义；2.与sham组相比,I/R组及不同剂量药物干预组大鼠在缺血30 min末、再灌注90 min末和120 min末的HR、LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的绝对值降低,LVEDP升高,再灌注120 min末的血浆MDA含量升高、CK-MB活性升高,SOD活性下降,N-RIP3、 P-RIP1增高,心肌凋亡细胞比例增高；3.与I/R组相比,高剂量SY组及Eda组大鼠在再灌注90 min末及120 min末LVDP、 +dp/dtmax、-dp/dtmax的绝对值升高,LVEDP降低。再灌注120 min末的血浆MDA含量、CK-MB活性降低,SOD活性升高,N-RIP3、P-RIP 1表达降低,心肌梗死面积及心肌凋亡细胞比例降低,心肌病理改变减轻。SY低剂量组和中剂量组各项指标与I/R组相比较,差异无统计学意义,心肌病理改变差异不明显；4.与低剂量、中剂量组相比,高剂量组在再灌注90 min末及120 min末,LVDP、 dp/dtmax、-dp/dtmax的绝对值升高,LVEDP降低,再灌注120 min末的血浆MDA含量降低、CK-MB活性下降、SOD活性升高,N-RIP3、P-RIP1降低,心肌梗死面积及心肌凋亡细胞比例显著降低。研究结论1.在体大鼠MIRI中,氧自由基(OFR)过量生成,RIP3硝化增多并被激活,促进下游信号分子RIP1的磷酸化,加重MIRI2.SY具有清除OFR作用,进而减少RIP3硝化及RIP1的磷酸化,对MIRI起到保护作用,且具有量效关系。第二部分：RIP3硝化对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及红花黄色素干预研究研究背景蛋白质翻译后的共价修饰有磷酸化、糖基化、乙酰化和硝化等。在细胞信号转导中,对蛋白质的磷酸化进行了广泛而深入的研究,而最近,蛋白质硝化也引起了关注。蛋白质硝化是指由NO自由基与02-迅速反应,在短时间内生成大量ONOO-,对细胞内蛋白质中的酪氨酸残基硝化生成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)。如果机体清除能力下降,不能清除过量的3-NT,体内多种有重要功能的蛋白功能将会受损或活性下降,不但使线粒体和DNA损伤,也会使酪氨酸磷酸化受到抑制,从而诱导细胞凋亡和衰老等级联反应过程。在某些病理条件下如应激和炎症等,在肺、肝脏和血管内皮中可以检测到3-NT,体内酪氨酸硝化的产生与分布决定于3-NT生成与定位。ONOO-生物学特性异常活跃,是一种强氧化剂,而且具有硝化功能,可以与生物大分子如蛋白质、脂质何核酸等反应。在正常情况下,蛋白质硝化反应存在很多正常组织中,信号途径的调节与体内低水平的蛋白质硝化反应有关。但是,过度的硝化则参与介导心脑血管疾病、炎性反应、缺血性脑损伤以及退行性神经紊乱等多种疾病的病理损伤过程。在体研究已经证实红花黄色素能通过减少RIP3硝化和RIP1的磷酸化而发挥保护作用。那么,在去除了神经内分泌等因素情况下,红花黄色素能否依然发挥可靠的心肌保护作用呢?如果有作用的话,是否也是抑制了RIP3的硝化来实现信号调控的呢?我们通过应用离体大鼠缺血再灌注损伤模型,给予不同剂量SY,研究其心肌保护作用强度及内在机制等。研究目的1.观察不同剂量SY对离体缺血再灌注大鼠心肌的血流动力学、心肌梗死面积、组织病理学、心肌细胞凋亡情况。2.观察N-RIP3及P-RIP1变化,阐明SY对离体心肌MIRI保护作用的分子信号传导机制。研究方法1.清洁级SD大鼠60只随机分为6组：空白对照组(A组),缺血再灌注组(B组)、低剂量SY组(10μmol/L, C组),中剂量SY组(30μmol/L, D组),高剂量SY组(90μmol/L, E组),依达拉奉组(F组)。大鼠肝素化,戊巴比妥麻醉后,取心,剪断大血管,主动脉保留3-4 mm,悬吊于Langendorff'恒压逆行灌注装置,左心耳处剪小口,置入水囊连接换能器,经模数转换器与计算机相连记录数据。2.心功能学指标监测同第一部分,监测缺血前即刻(T0)、缺血30 min末(T1)、再灌注30 min末(T2)、再灌注60 min末(T3)、再灌注90 min末(T4)和再灌注120 min末(T5)六个时间点的HR、LVDP、LVEDP和±dp/dtmax。3.测量心肌梗死面积、评估心肌细胞损伤及凋亡情况等方法学同第一部分。4.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)联合Western Blotting分析RIP1磷酸化、RIP3硝化水平。研究结果1.与对照组相比,IR组心功能指标明显减低,与IR组相比,药物干预组左心室心功能指标明显改善,中剂量SY组效果较好。2.与IR组相比,空白对照组、低剂量SY组、中剂量SY组和高剂量SY组以及依达拉奉组心肌梗死面积显著降低,而中剂量SY组梗死面积较小。各剂量药物处理组,在再灌注120 min末,心肌匀浆组织检测SOD活性升高,MDA含量下降。3.光镜下,对照组心肌纤维排列规则,界限清楚、横纹明显规则,IR组心肌纤维排列紊乱,且心肌纤维部分断裂明显,横纹不明显,各剂量SY组可见心肌纤维排列渐规则,断裂渐少,而依达拉奉组心肌纤维排列尚整齐,但较稀疏,可见横纹。可见棕黄色核的TUNEL阳性细胞,并且可见细胞空泡化,以IR组最为明显,SY、依达拉奉组心肌细胞凋亡比例下降；4.离体大鼠心肌再灌注120min末,各药物干预组的RIP3、RIP1表达水平均降低,中、高剂量SY及依达拉奉的RIP3硝化水平降低,低剂量SY组的RIP3表达水平及RIP3硝化水平高,而高剂量SY组和依达拉奉组的RIP3表达水平低,低、高剂量SY组和依达拉奉组的RIPl表达量低。IR时,RIP3硝化水平上升,SY或依达拉奉干预后,可降低RIP3的硝化水平。RIP1表达水平上升,且不同SY浓度对RIPl表达水平影响不同。研究结论1.大鼠离体心脏缺血再灌注损伤时,RIP3的硝化水平升高,并促进下游RIP1磷酸化水平升高,二者诱导细胞凋亡,加重心肌损伤；2.SY通过降低RIP3硝化、RIP1磷酸化,减轻自由基损伤,降低心肌细胞凋亡比例,对缺血再灌注损伤心肌发挥保护作用,且其作用呈剂量依赖性。第三部分：PYK2的巯基亚硝基化在缺血再灌注损伤的相关性及活化位点研究研究背景富含脯氨酸的蛋白酪氨酸激酶2(PYK2,也称作细胞粘附激酶-β, RAFTK,或CADTK)是粘着斑激酶家族非受体酪氨酸激酶成员,PYK2参与G蛋白偶联受体的信号转导,烟碱型乙酰胆碱受体,细胞膜去极化和应力。PYK2由FERM,激酶结构域,富含脯氨酸的区域,和粘着定位(脂肪)域组成。位于FERM和激酶结构域之间第402位酪氨酸的自身磷酸化促使PYK2的活化。有研究显示,PYK2酪氨酸的磷酸化在细胞中的分布已经由其酪氨酸磷酸化抗体检测到。它的主要自身磷酸化位点是402位的酪氨酸。缺血可以导致PYK2的活化,缺血短时期诱导的钙离子大量内流,导致细胞内钙超载。内源性的NO是通过一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸合成的,它与蛋白分子的半胱氨酸巯基亚硝基化(S-亚硝基化)相互联系。S-亚硝基化,NO类化合物可以对同型半胱氨酸侧链进行共价修饰,是一种重要的翻译后修饰,对蛋白质功能具有重要的的调控作用。细胞内Ca2+的靶向蛋白有磷酸酶,蛋白激酶,和NOS。nNOS主要应答钙-钙调蛋白信号通路。有意义的是,一些研究表明,PYK2是一种被雌激素诱导的ROS激活,对氧化还原敏感的激酶。但PYK2的激活机制还没有完全阐明。根据以上所述,我们推测,在细胞经过OGD后,通过NMDAR介导的Ca2+内流导致了钙-钙调素信号化合物的形成。这种化合物使得内源性的NO合成增加,导致PYK2蛋白S-亚硝基化,而激活PYK2,最终导致了细胞死亡。在本研究中,我们首先检测,一氧化氮供体GSNO使培养的细胞内过表达的PYK2巯基亚硝基化,其次,在大鼠缺血复灌不同的时间点可以诱导PYK2的巯基亚硝基化和活化。研究目的1.检测外源性一氧化氮使PYK2巯基亚硝基化。2.检测缺血再灌注诱导的内源性NO导致PYK2巯基亚硝基化和活化。3.检测介导PYK2巯基亚硝基化的位点。研究方法1.利用PYK2-SPORT6质粒为模板构建PYK2突变体质粒。PYK2酶活性区域的每个半胱氨酸(C)残基突变为甘氨酸(G)。2.应用生物素转化法测定PYK2的巯基亚硝基化情况。3.免疫印迹对P-PYK2(活化的PYK2)进行检测。4.DAPI染色检测凋亡样细胞死亡。研究结果1.在培养的HEK-293细胞中,用GSNO处理,过表达的PYK2能形成一个显著的亚硝基化蛋白,且与GSNO呈浓度和时间依赖性,NEM可以与蛋白质的自由巯基反应使之烷基化从而封闭巯基。给予NEM后,用GSNO处理的细胞,PYK2的巯基亚硝基化被完全抑制。当加入nNOS抑制剂7NI时,再给予钙载体A23187, PYK2的巯基亚硝基化也被抑制。2.通过对膜上PYK2巯基亚硝基化条带密度的测定,与野生型相比,C534G突变体下降约86%。3. OGD 6 h和12h后野生型PYK2的亚硝基化使得其功能活性有着显著的提升,C534G突变体与野生型相比,PYK2的亚硝基化和磷酸化水平明显下降,在过表达C534G突变体PYK2的SH-SY5Y细胞中,细胞凋亡明显减少。研究结论1.PYK2能被外源性NO (GSNO)或nNOS产生的内源性NO亚硝基化。2.PYK2的534位半胱氨酸为其承担巯基亚硝基化的位点。3.PYK2的巯基亚硝基化参与了其活化。
【关键词】：红花黄色素 心肌缺血再灌注 RIP3 RIP1 硝化 红花黄色素 心肌缺血再灌注 RIP3 硝化 富含脯氨酸的蛋白酪氨酸激酶2 缺糖缺氧 亚硝基化
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 中文摘要7-17
• 英文摘要17-27
• 符号说明27-29
• 前言29-39
• 参考文献35-39
• 第一部分 RIP3硝化在在体大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及红花黄色素的干预研究39-75
• 研究背景39-40
• 1.材料与方法40-55
• 2.结果55-57
• 3.讨论57-63
• 4.结论63-64
• 附图表64-71
• 参考文献71-75
• 第二部分 RIP3硝化在离体大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及红花黄色素的干预研究75-98
• 研究背景75-76
• 1.材料与方法76-79
• 2.结果79-81
• 3.讨论81-86
• 4.结论86-87
• 附图表87-94
• 参考文献94-98
• 第三部分 PYK2巯基亚硝基化在缺血再灌注损伤中的相关性及位点鉴定98-114
• 研究背景98-99
• 1.材料与方法99-102
• 2.结果102-104
• 3.讨论104-105
• 4.结论105-106
• 附图表106-111
• 参考文献111-114
• 致谢114-115
• 攻读学位期间发表的学术论文目录115-116
• 学位论文评阅及答辩情况表116-117
• 英文文章1117-135
• 英文文章2135-147

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 吴伟;金鸣;朴永哲;李金荣;;红花黄色素缓解大鼠心肌缺血的作用[J];中草药;2007年09期

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本文编号：706597