瘦素信号通路及脂联素信号通路与2型糖尿病的关联研究

发布时间：2017-08-22 17:02

  本文关键词：瘦素信号通路及脂联素信号通路与2型糖尿病的关联研究

  更多相关文章： 2型糖尿病 遗传流行病学 SNP-SNP互作 通路分析

【摘要】：研究背景与研究目的：调查数据显示,糖尿病的发病率和患者数量在世界范围内迅速上升,估计到2030年全球糖尿病患者将接近5亿,其中2型糖尿病是最主要和增长最快的糖尿病类型,占整个糖尿病人群的90%以上,我国已成为世界上糖尿病患病数最多的国家,2型糖尿病也已成为严重的公共卫生问题之一,给社会、经济以及人们的健康带来了沉重的负担。但由于病因和发病机制尚未完全明确,使得对2型糖尿病的预防和治疗存在较大困难。目前,2型糖尿病的病因学研究认为,2型糖尿病是遗传因素和环境因素共同参与和相互作用导致的复杂疾病。这些因素通过大多未知的机制导致骨骼肌、脂肪和肝脏的胰岛素抵抗和(或)β细胞功能障碍,然后胰岛素抵抗合并胰岛素分泌不足造成餐后和空腹血糖升高,最终形成糖尿病。而高血糖和相关的代谢异常又进一步改变信号转导和基因表达,即糖脂毒性,形成恶性循环。患病率的上升固然与过量饮食、运动量减少等因素有关,而遗传因素是不容忽视的重要内因。以往大量研究证据已表明2型糖尿病是遗传性疾病,这些证据包括：同卵双胞胎间2型糖尿病发病的高一致性,2型糖尿病的家族聚集性,以及不同种族间2型糖尿病发病率的巨大差异。近年来国内外学者进行了大量的遗传流行病学研究,希望找到2型糖尿病的易感基因,以更好地理解其遗传学基础和发病机制。截至目前,主要有以下几种遗传流行病学的研究策略和方法用于2型糖尿病易感基因的定位和识别：(1)连锁分析：连锁分析是较早用于定位2型糖尿病易感基因的方法。目前,已在20多个种族人群(如芬兰人、墨西哥裔美国人、美国白人、英国人、日本人、法国人、中国北方和南方汉族人等)中进行全基因组扫描及微卫星标记与2型糖尿病的连锁分析,结果显示2型糖尿病的易感位点位于多条染色体上,并且在多个人群中得到验证。(2)候选基因关联研究：候选基因关联研究是根据某些间接线索(如连锁分析的结果或者基因表达产物的功能信息等)选定一个或几个候选基因,借助于直接测序或等位基因特异性扩增等实验方法,通过在病例和对照中比较候选基因序列差异,来确定这些候选基因与患病状态或数量性状间是否存在关联。自20多年前第一篇胰岛素基因与2型糖尿病的关联研究发表以来,与胰腺发育的分子机制、胰岛素信号转导和胰岛素分泌等有关的2型糖尿病的候选基因明显增多,但小型的候选基因关联研究的结果可重复性较差,仅PPARG和KCNJ11得到较好的重复。(3)全基因组关联研究(Genome-wide association study, GWAS):它以人类基因组中数以百万计的SNP为标记进行病例-对照关联分析,以期发现与复杂疾病相关的遗传变异。自2007年Sladek等在Nature上发表第一篇关于2型糖尿病的全基因组关联分析以来,在不同种族、不同人群中开展的2型糖尿病全基因组关联分析有30余项,报道的关联位点139个,被不同研究验证的60多个。这些发现为了解2型糖尿病的发病机制提供了更多的线索,但是它们还是不能全面系统地阐释2型糖尿病的遗传机制,存在着严重的“遗失遗传度”现象。这可能与全基因组关联分析的局限性有关。针对这种情况,一些新的策略和方法已经被尝试应用到GWAS的后续研究中,如基因-基因交互作用研究、基于通路的关联分析等。(4)基因-基因交互作用研究：基因-基因交互作用主要指非等位基因间的相互作用,有的文献中也称上位效应,它可能是导致复杂疾病的主要因素之一。复杂疾病大多受到微效基因的影响,这些影响更可能通过交互作用分析被检测出来。基因-基因交互作用研究不仅可以提高发现基因与疾病关联的功效,而且有助于我们对与疾病相关生物学通路的理解。已发现UCP2和PPARy基因中的两位点互作与2型糖尿病关联,与肥胖相关候选基因的SNP-SNP互作也可以增加患2型糖尿病的风险。(5)基于通路的关联分析：通路分析是近年来发展的基于先验知识的下游功能学分析方法,它以已有的先验通路(如KEGG、Biocarta和Gene Ontology等数据库中的通路)中的基因集为分析单元,在基因集水平上寻找疾病关联的通路及生物学功能,评估通路对疾病风险的贡献。以功能相关的基因集为分析单元符合复杂疾病的多基因遗传特性,一方面可以起到降维的目的,减少多重比较的次数,增加了检验效能,另一方面考虑了同一功能基因集中基因间的相互作用,并把复杂的基因互作看作一个整体纳入分析,能更好地识别互作效应和挖掘出具备功能学意义的互作基因,所得结果也更具有生物学解释能力。在前期研究工作中,我们发现脂肪细胞因子信号通路可能是与2型糖尿病关联较密切的一条通路。脂肪细胞因子信号通路包含3条子通路,其中瘦素(leptin, LEP)信号通路和脂联素(adiponectin, ADIPO)信号通路一直是生物医学领域研究的热点。因此,本研究拟选取LEP信号通路和ADIPO信号通路进行深入探讨,分析基因中单个SNP与2型糖尿病的关联、同一基因多个SNP的连锁不平衡和LD block内的单倍型、SNP-SNP的交互作用以及在通路水平上SNP集与2型糖尿病的关联,以期发现新的有意义的SNP位点、SNP对子和SNP组合,为进一步研究2型糖尿病的发病机制和寻找可能的药物作用靶点提供线索,为个体2型糖尿病发病风险的预测及早期干预提供依据。材料与方法：本研究采用病例对照设计,病例为确诊的2型糖尿病患者,来自广东医学院附属医院、茂名市人民医院、韶关市人民医院、东莞市石龙博爱医院、东莞厚街人民医院、深圳龙华人民医院、深圳市南山人民医院、深圳市观澜人民医院、深圳市西乡人民医院、深圳市福田人民医院等10所医院的内分泌科。对照为与病例同时期在同一家医院体检的健康人群。按照所在地区和性别将病例组和对照组受试者进行匹配。由统一培训的调查员对符合纳入标准的研究对象进行标准化的问卷调查,内容包括年龄、性别、籍贯、职业、疾病史、病程、吸烟史、家族史、并发症、饮食及运动情况等。采取受试者外周血,一部分用于生化检测,一部分冷藏用于提取DNA。提取DNA后,用SNPscanTM多重SNP分型试剂盒对选择的48个SNP——LEP通路中15个基因(LEP、LEPR、JAK1、JAK2、STAT3、SHP-2、 PPARGC1A、PRKAA1、PRKAA2、PRKAB2、 PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3、 alpha-MSH、NPY) 的 23 个 SNP(rs4731426、rs2167270、rs12405556、rs17127107、 rs 10889502、rs7849191、rs9891119、rs4767860、rs2970847、rs6821591、rs249429、 rs3805486. rs1342382、rs6588640、rs6937、rs3766522、rs10783299、rs5017427、 rs9648724、rs645163、rs6436094、rs6713532、rs16147)和ADIPO通路中14个基因 (ADIPOQ, ADIPOQR1、ADIPOQR2, PPAR-alpha、PCK1、PCK2、G6PC, ACC2、GLUT1、GLUT4、CPT-1、RXRA、RXRB、RXRG) 的 25 个 SNP (rs266729、rs16861205、rsl342387、rs12733285、rs767870、rs1044471、rs4823613、 rs5767743、rs1042531、rs11908628、rs2301336、rs4982856、rs2593595、rs2268388、 rs3754219、rs12718444、rs5435、rsl6956647、rs11228368、rs11185660、rs1045570. rs2744537、rs2076310、rs1467664、rs3753898)进行分型。将核查后的问卷信息、体格检查及临床生化检查结果与SNP数据整合,用于统计分析。受试者的基本信息及生理生化指标等采用t检验或者卡方检验进行比较；单个SNP与2型糖尿病的关联分析采用Pearson卡方检验、Cochran-Armitage趋势检验、MAX3、logistic回归等方法；LD block内的单倍型分析采用非条件Logistic回归分析;SNP-SNP互作分析也采用logistic回归模型；通路分析采用基于logistic kernel machine regression的SNP集分析方法。所有统计学分析由SPSS15.0. PLINK1.07、R2.14.2、Haploview4.2、SNPstats等统计软件包完成。结果：(1)LEP通路与2型糖尿病的关联分析结果：单位点关联分析中,rs2167270在未调整协变量和调整协变量显性模型下均有统计学意义,在未调整协变量和调整协变量共显性模型下,基因型AG相对于基因型GG均有统计学意义,在未调整协变量超显性模型下有统计学意义,但在调整协变量超显性模型下无统计学意义；rs16147在稳健检验、隐形模型、超显性模型下调整协变量前和调整协变量后均有统计学意义。连锁不平衡分析发现,我们所检测LEP基因的rs2167270和rs4731426、JAK1基因的rs10889502和rs17127107、PPARGC1A基因的rs2970847和rs6821591、PRKAA1基因的rs249429和rs3805486、PRKAA2基因的rs1342382和rs6588640、PRKAB2基因的rs3766522和rs6937、PRKAG2基因的rs2970847和rs6821591、PRKAG3基因的rs6436094和rs645163等8个基因内的各自2个位点之间存在连锁不平衡关系；非条件Logistic回归分析未发现各基因内LDblock的单倍型有统计学意义的阳性结果。LEP通路与ADIPO通路两条通路下的29个基因48个SNP互作分析得到15对有统计学意义的结果,它们对应的基因分别为：SLC2A1与LEP, PRKAA2与PCK2, PRKAA2与G6PC, JAK1与PRKAG3, RXRG与NPY, PRKAG3与DDN, PPARGC1A与LEP, PPARGC1A与PCK2,PRKAA1与PPARA, PRKAA1与PPARA, NPY与ADIPOR2, LEP与SLC2A4, LEP与SLC2A4, LEP与PCK1, STAT3与PCKl,其中LEP、JAK1、STAT3、PPARGC1A、PRKAA1、PRKAA2、 PRKAG1、PRKAG3、NPY等9个基因存在于LEP通路中,其余8个基因存在于ADIPO通路中,LEP通路中仅有2对有统计学意义的SNP-SNP互作;LEP、 PRKAA2、PCK2、PRKAG3、NPY、PPARGCIA、PCK1与其他基因存在较多的互作,尤其是与LEP存在互作的基因多达4个,提示这些基因在糖脂代谢中可能具有比较重要的作用,LEP可能存在较为关键的作用；此外PRKAA1与PPARA、LEP与SLC2A4的4个SNP分别存在2对有意义的互作,提示PRKAA1与PPARA、LEP与SLC2A4之间可能有比较紧密的关系；rs16147和rs2167270均被包含在内,可看作rs16147和rs2167270与2型糖尿病关联的另一个证据。无论是否加入协变量,LEP通路与2型糖尿病的关联均无统计学意义。(2)ADIPO通路与2型糖尿病的关联分析结果：单位点关联分析中,rs3753898在等位基因关联分析、基因型关联分析、稳健检验及调整协变量后均有统计学意义,得到了稳定一致的结果；rs1042531在未调整协变量和调整协变量超显性模型下均有统计学意义,在调整协变量共显性模型下,基因型TG相对于基因型TT有统计学意义,基因型GG相对于基因型GG无统计学意义；rs12718444在未调整协变量和调整协变量隐形模型下均有统计学意义,在调整协变量共显性模型下,基因型TG相对于基因型GG无统计学意义,基因型TT相对于基因型GG有统计学意义；rs1044471在未调整协变量的超显性遗传模型下有统计学意义,但是调整协变量后两者均无统计学意义,说明它们可能受到协变量的影响。连锁不平衡分析发现,我们所检测ADIPOQ基因的rs16861205和rs266729、ADIPOR1基因rsl2733285和rs1342387、ADIPOR2基因的rs1044471和rs767870、PPARA基因的rs4823613和rs5767743、PCK1的rs1042531和rs11908628、PCK2基因的rs2301336和rs4982856、SLC2A1基因的rs12718444和rs3754219、SLC2A4基因的rs16956647和rs5435、RXRB基因的rs2076310和rs2744537、RXRG基因的rsl467664和rs3753898等10个基因内的各自2个位点之间均存在连锁不平衡关系；非条件Logistic回归分析发现RXRG基因内rs1467664的等位基因T与rs3753898的等位基因A构成的单倍型是2型糖尿病发生的高危因素,提示对于中国汉族人群来说,RXRG基因的遗传变异可能是引起糖尿病发生的遗传因素；此外,可看作rs3753898与2型糖尿病关联的另一个证据。ADIPO通路中基因14个基因25个SNP进行SNP-SNP互作分析,未发现有统计学意义的SNP-SNP互作。但在LEP通路中基因与ADIPO通路中基因SNP-SNP联合互作分析中,ADIPO通路中的ADIPOQR2、PPARA、PCK1、PCK2、 G6PC、GLUT1、GLUT4、RXRG等8个基因与LEP通路下的基因存在SNP-SNP互作关系,该通路的基因可能与LEP通路中的基因共同发挥作用；其中rs1042531被包含在互作中,可看作rs1042531与2型糖尿病关联的另一个证据。无论是否加入协变量,ADIPO通路与2型糖尿病的关联均无统计学意义。结论：(1)LEP通路中的rs2167270和rs16147与2型糖尿病存在关联；ADIPO通路中的rs3753898、rs1042531、rsl2718444与2型糖尿病存在关联。(2) ADIPO通路中RXRG基因内rs1467664的等位基因T与rs3753898的等位基因A构成的单倍型是2型糖尿病发生的高危因素。(3)LEP通路与ADIPO通路两条通路下基因中的SNP存在多对有统计学意义的互作,SNP-SNP互作可以增加患2型糖尿病的风险,是2型糖尿病遗传结构的组成部分。(4)根据logistic kernel machine regression结果,尚不能认为LEP通路及ADIPO通路与2型糖尿病存在关联。
【关键词】：2型糖尿病 遗传流行病学 SNP-SNP互作 通路分析
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 第1章 绪言22-32
• 1.1 研究背景22-29
• 1.2 研究目的及意义29-31
• 1.3 研究思路31-32
• 第2章 资料的收集整理与分析32-55
• 2.1 研究对象32
• 2.2 资料收集与血样采集32-33
• 2.3 资料整理与数据库的建立33
• 2.4 DNA提取33-35
• 2.4.1 主要试剂及来源33-34
• 2.4.2 主要实验器材及来源34
• 2.4.3 基因组DNA提取步骤34-35
• 2.5 SNP筛选与分型35-42
• 2.5.1 主要试剂及来源38
• 2.5.2 主要实验器材及来源38-39
• 2.5.3 SNP分型原理及操作步骤39-42
• 2.6 质量控制42
• 2.6.1 数据收集过程中的质量控制42
• 2.6.2 SNP分型的质量控制42
• 2.7 统计分析方法及其相关统计软件包42-55
• 2.7.1 病例组与对照组基线资料的均衡性检验42-43
• 2.7.2 单个SNP与2型糖尿病的关联分析43-50
• 2.7.3 连锁不平衡分析和基于单倍型的关联分析50-51
• 2.7.4 SNP-SNP互作分析51
• 2.7.5 通路分析51-55
• 第3章 LEP通路与2型糖尿病的关联分析55-80
• 3.1 前言55-56
• 3.2 结果56-73
• 3.2.1 病例组与对照组基线资料的均衡性检验结果56
• 3.2.2 SNP分型结果56-57
• 3.2.3 等位基因关联分析结果57
• 3.2.4 基因型关联分析结果57-66
• 3.2.5 连锁不平衡分析和基于单倍型的关联分析结果66-71
• 3.2.6 SNP-SNP互作结果71-73
• 3.2.7 通路分析结果73
• 3.3 讨论73-78
• 3.3.1 单位点关联分析74-75
• 3.3.2 连锁不平衡分析和基于单倍型的关联分析75
• 3.3.3 SNP-SNP互作分析75-78
• 3.3.4 通路分析78
• 3.4 小结78-80
• 第4章 ADIPO通路与2型糖尿病的关联分析80-107
• 4.1 前言80-81
• 4.2 结果81-102
• 4.2.1 SNP分型结果81
• 4.2.2 等位基因关联分析结果81-85
• 4.2.3 基因型关联分析结果85-93
• 4.2.4 连锁不平衡分析和基于单倍型的关联分析结果93-101
• 4.2.5 SNP-SNP互作结果101
• 4.2.6 通路分析结果101-102
• 4.3 讨论102-106
• 4.3.1 单位点关联分析102-104
• 4.3.2 连锁不平衡分析和基于单倍型的关联分析104-105
• 4.3.3 SNP-SNP互作分析105
• 4.3.4 通路分析105-106
• 4.4 小结106-107
• 第5章 总结107-111
• 5.1 主要结果与结论107-109
• 5.1.1 主要结果107-109
• 5.1.2 结论109
• 5.2 特色与优势109-110
• 5.3 不足之处110
• 5.4 研究展望110-111
• 参考文献111-125
• 附录1 缩写词中英文对照125-128
• 附录2128-131
• 攻读学位期间成果131-132
• 致谢132-134

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本文编号：720301