基于转录组芯片筛选的新型LncRNA在CAD早期诊断中的作用及分子机制研究

发布时间：2017-08-29 16:06

  本文关键词：基于转录组芯片筛选的新型LncRNA在CAD早期诊断中的作用及分子机制研究

  更多相关文章： 冠心病 长链非编码RNA 诊断 生物标志物 外周血单核细胞 冠心病 长链非编码RNA micro RNA PTEN 内皮细胞

【摘要】：第一部分研究背景和目的:心血管疾病仍然是当前人类死亡的主要原因之一,而动脉粥样硬化(AS)及其血栓形成又是导致心血管疾病的主要原因。在心脏,AS引起冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAD),尽管目前针对CAD的治疗有效,主要包括调脂治疗和以PCI(经皮冠状动脉介入)或CABG(冠状动脉旁路搭桥手术)术后联合抗凝和(或)抗血小板治疗为代表的血运重建,但是CAD的死亡率仍维持高位。CAD早期诊断可能有助于及早干预,取得良好预后。因此,及早诊断CAD意义重大。近年来,随着全基因组分析技术的快速发展,研究发现几乎所有人类的基因组都能转录并且产生大量长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,lnc RNAs)。Lnc RNAs是一类长度大于200nt,甚至超过10knt的不能编码蛋白的RNA分子。研究发现lnc RNA可通过表观遗传,转录及转录后等多个层面调控基因表达,参与疾病病理生理过程,如肿瘤,自身免疫性疾病和神经功能紊乱等。最近研究表明,一些lnc RNAs参与包括心脏衰竭,心肌肥大,心脏代谢疾病、心肌梗塞和AS等各种类型心血管疾病的发生发展。同时,一些lnc RNAs还可作为许多疾病的诊断及判断预后的生物标志物,例如尿液中前列腺特异性的linc RNA PCA可用来诊断前列腺癌,血浆里的lnc RNA HULC可用于检测肝细胞癌,H19可诊断胃癌,LIPCAR可准确预测心梗后心衰病人的预后。但是,目前还没有关于循环血液中的lnc RNA作为早期诊断CAD的生物标志物的报道。近来CAD被认为是一种慢性炎性疾病,主要累及大-中肌型动脉,以动脉粥样硬化斑块形成为特征。已有研究证实在外周血中占粒细胞总数约5-10%的单核细胞在AS形成这一病理过程中发挥重要作用。本课题将系统地研究CAD病人单核细胞在转录组表达谱的变化,筛选新型CAD相关的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA),建立早期诊断CAD的"lnc RNA分子诊断模型",并对该模型的准确性和有效性进行验证。在此基础之上,研究其生物学功能,全面评估其在CAD发生发展中的作用。方法:第一章本研究共入选了502例在本科介入中心接受冠脉造影的CAD及对照患者,病人的相关临床资料完整。采用lnc RNA表达谱芯片对15例男性CAD病人和15例男性对照患者单核细胞和血浆进行研究,采用实时定量PCR方法在相同的单核细胞样本里验证了芯片结果,接着我们又在另一个20×20的人群对筛选的3个lnc RNAs进行了验证及ROC曲线分析。我们进一步扩大样本量(211×171)对Coro Marker与CAD之间的关系进行病例对照研究,并随机抽样分为训练样本161×121和验证样本(50×50),根据训练样本构建"Coro Marker分子Fisher判别模型",同时对对照研究人群、训练样本和验证样本分别进行ROC曲线分析和危险因素分析。同时,在一个独立人群(50×40)进行前瞻性的诊断研究。最后,在不同心血管疾病中对其特异性检测。第二章根据芯片结果,筛选差异基因并对其进行GO、Pathway、共表达网络及功能富集分析,同时,在体外应用电转的方法,特异性si RNA敲降Coro Marker的表达,观察THP-1细胞增殖及炎性细胞因子分泌等生物学行为的变化。结果:第一章根据lnc RNA表达谱芯片结果,我们成功筛选到51个在CAD病人单核细胞和血浆中同时高表达的lnc RNAs,进一步筛选出其中5个差异显著高丰度表达的lnc RNAs,在(20×20)人群中,采用q PCR及ROC曲线分析方法分析得到在CAD病人单核细胞中高表达的3个lnc RNA(Coro Marker,IL21R和BAT5),AUC分别为0.94、0.825和0.818,故确定Coro Marker为研究对象。在接下来的临床大样本(211×171)验证过程中,根据最优抽样效果构建Coro Marker的Fisher判别模型,Fisher判别函数:f=-3.05212x+4.648898。x为Coro Marker的表达值,当x=1.523时,该个体就是CAD患者,x1.523时,则为非CAD患者。样本集模型(100次抽样对应的100个模型)判断结果提示:平均正确判别率为0.81,最大正判率为0.89,最小正判率为0.74;其中,冠心病组平均正判率为0.65,最大正判率为0.82,最小正判率为0.50;而对照组平均正判率为0.97,最大正判率为1.00,最小正判率为0.90。冠心病平均正判32例,误判为对照组18例;对照组平均正判48例,误判为冠心病2例。该模型判断最优结果提示:分类总正判率为0.89,其中冠心病组达到0.80,对照组高达0.98。冠心病组正判40例,误判为对照组10例,对照组正判高达49例,误判为冠心病只有1例。而ROC分析结果表明总体样本中AUC为0.92,95%CI(0.892-0.947),而第15次抽样对应的训练样本及验证样本中AUC分别为0.905,95%CI(0.869-0.940)和0.96,95%CI(0.923-0.997)。危险因素分析结果提示Coro Marker不受CAD传统危险因素的影响,单因素及多因素分析结果提示Coro Marker可作为诊断CAD的独立危险因素。独立前瞻性研究结果提示,该模型能够分别在50例CAD病人中正判38例,在40例对照组患者中正判37例,相应的敏感性和特异性分别为76%和92.5%。相较其他的心血管疾病,Coro Marker在CAD中特异性高表达。第二章根据芯片结果,筛选得到差异基因共556个,GO分析发现,上调差异基因主要参与signal transduction,small molecule metabolic process和transmembrane transport等相关细胞生理功能,而下调差异基因的功能注释主要表现在small molecule metabolic process,inflammatory response,lipopolysaccharide-mediated signaling pathway和lipid metabolic process等过程。Pathway分析提示,冠心病组外周血单核细胞上调差异基因主要参与Jak-STAT signaling pathway,Vascular smooth muscle contraction,Leukocyte transendothelial migration和Metabolic pathways等细胞信号转导途径,而下调差异基因主要参与Rheumatoid arthritis,Chemokine signaling pathway,Toll-like receptor signaling pathway,Antigen processing and presentation,Metabolic pathways和Apoptosis等与炎症、免疫和凋亡相关的细胞信号转导途径。相关基因功能富集分析表明,在相关系数r≥0.99,FDR≤7.61E-05的情况下,在外周血单核细胞差异基因中筛选出35个编码蛋白的m RNA与Coro Marker正相关。对这35个m RNAs的生理功能进行GO分析,发现其功能主要富集在信号转导和小分子代谢等方面;运用同样的方法,我们分析在r-0.900,FDR≤9.83E-05的情况下,筛选出33个编码蛋白的m RNA与Coro Marker负相关。对这33个负相关m RNAs的生理功能进行GO分析,提示其功能主要富集在先天免疫、细胞因子介导的信号途径和凋亡过程介导的信号途径等。体外功能实验研究结果表明,THP-1细胞中Coro Marker的表达降低可以显著减弱THP-1细胞的增殖能力,同时也降低炎性细胞因子IL-1β、IL6和TNFα的分泌。结论:(1)首次筛选出CAD病人单核细胞高表达的Coro Marker。(2)建立了lnc RNA的"Coro Marker分子诊断模型",可早期预测CAD的发生发展。(3)Coro Marker可通过促进单核细胞增殖和分泌炎性细胞因子导致CAD的病理形成。第二部分研究背景和目的:在第一部分研究工作中,我们证实单核细胞高丰度表达的Coro Marker可作为早期诊断CAD的一个新型生物标志物;在功能初步验证中,研究分析Coro Marker可通过发挥促炎和促单核细胞增殖的作用导致CAD发生发展。同时,我们研究发现CAD病人单核细胞里高丰度表达的Coro Marker并不能很好解释其在血浆里的高丰度表达,相关性分析结果R2=0.276,提示血浆里Coro Marker仅部分来源于单核细胞,Coro Marker存在其他来源途径。近年来研究表明,动脉血管内皮在血管稳态的维持方面扮演重要分泌器官的角色,通过分泌多种物质,发挥重要的调节作用,维持血管稳态。前期预实验结果提示Coro Marker在HUVEC高丰度表达,我们合理推测可能由各种危险因素引起血管内皮功能失调,致内皮细胞分泌大量Coro Marker入血,导致CAD的发生发展。本实验的目的就是探讨CAD病人动脉血管内皮高丰度表达的Coro Marker在CAD病理形成中的作用及分子机制。方法:第一章我们运用percoll液分选外周血循环内皮细胞,通过q PCR方法研究循环内皮细胞Coro Marker在CAD组和非CAD组之间的差异表达;在HUVEC细胞系上,构建稳转sh RNA-Coro Marker细胞系;ELISA检测细胞培养上清液中相关炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNFα的分泌。第二章运用荧光原位杂交和核质分离的方法研究Coro Marker在内皮细胞中的亚定位;3‘及5‘RACE和northern blot的方法获取并验证Coro Marker的全长序列;生物信息学分析Coro Marker可能的作用,并用双荧光素酶报告基因的方法研究Coro Marker与mir205-5P的直接作用;Wester Blot及q PCR的方法研究基因在转录及转录后的表达。结果:第一章q PCR结果表明Coro Marker在冠心病人循环内皮细胞上的表达(5.156±0.896),95%CI(0.565,1.397),较对照组患者循环内皮细胞上的表达(0.981±0.176),95%CI(3.036,7.275),显著升高(P0.05);对Coro Marker的功能进行研究,在成功干扰Coro Marker 70%的时候,ELISA法检测细胞培养上清液中炎性细胞因子IL-1β、IL6和TNFα的结果提示Coro Marker干扰组IL-1β(P=0.0398)、IL6(P=0.000)和TNFα(P=0.017)的分泌较对照组和阴性对照组,皆显著降低(P0.05),而IL-1β、IL6和TNFα在对照组和阴性对照组之间无明显差异(P0.05),n=6。第二章荧光原位杂交实验结果提示,带cy3标记的Coro Marker主要集中在HUVEC细胞的胞浆中;核质分离实验的结果进一步证实胞浆中Coro Marker的表达是细胞核中的2.5倍。在HUVEC细胞上,分别通过3‘和5‘RACE,获取了Coro Marker的全长序列,共有1394nt;并通过Northern blot实验进一步证实Coro Marker基因条带对应在1500bp附近,和RACE结果一致。继而生物信息学分析提示Coro Marker可以和micro RNA205-5P互补结合;q PCR研究结果表明干扰Coro Marker组micro RNA205-5P的表达较对照组及干扰阴性对照组皆显著下降(P0.05);双荧光素酶报告基因实验结果提示,lnc RNA可显著增强mi R-205的表达(P0.05),luciferase活性较对照组增强近2倍。q PCR及WB检测结果皆表明作为micro RNA205-5P靶基因的PTEN在Coro Marker干扰组中显著上调,同时干扰PTEN可使Coro Marker促进炎性细胞因子的分泌得到部分恢复。结论:(1)首次成功鉴定出CAD的致病基因Coro Marker.(2)首次证明Coro Marker主要分布在细胞浆中,并可直接调控micro RNA205-5P的启动子。(3)首次证明了Coro Marker-micro RNA205-5P-PTEN这一信号通路在CAD发生发展中的作用。
【关键词】：冠心病 长链非编码RNA 诊断 生物标志物 外周血单核细胞 冠心病 长链非编码RNA micro RNA PTEN 内皮细胞
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.4
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 英文摘要7-15
• 中文摘要15-20
• 第一部分 单核细胞lnc RNA作为诊断CAD新型分子标志物的筛选及其功能研究20-88
• 第一章 前言20-24
• 第二章 lnc RNA-Coro Marker作为早期诊断冠心病的新型分子标志物的筛选，诊断模型的建立24-70
• 2.1 材料和方法24-32
• 2.2 实验结果32-67
• 2.3 讨论67-69
• 2.4 小结69-70
• 第三章 Coro Marker的功能分析及验证70-88
• 3.1 材料与方法70-76
• 3.2 实验结果76-84
• 3.3 讨论84-87
• 3.4 小结87-88
• 第二部分 内皮细胞Coro Marker在CAD发生发展中的作用及分子机制研究88-136
• 第一章 前言88-91
• 第二章 内皮细胞Coro Marker在CAD发生发展中的作用及功能研究91-104
• 2.1 实验材料与方法91-98
• 2.2 实验结果98-102
• 2.3 讨论102-103
• 2.4 小结103-104
• 第三章 内皮细胞Coro Marker在CAD发生发展中的分子机制研究104-136
• 3.1 材料与方法104-124
• 3.2 实验结果124-134
• 3.3 讨论134-135
• 3.4 小结135-136
• 全文总结136-137
• 参考文献137-145
• 文献综述 RNA干扰疗法在心血管疾病中的应用145-156
• 参考文献151-156
• 攻读博士期间发表的论文156-157
• 致谢157

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本文编号：754181