基于体外细胞培养的鼠李糖脂毒理与药理作用研究

发布时间：2017-08-31 21:02

  本文关键词：基于体外细胞培养的鼠李糖脂毒理与药理作用研究

  更多相关文章： 鼠李糖脂 毒性机理 口服促吸收剂 抗纤维化 表面张力

【摘要】：鼠李糖脂是一种生物表面活性剂,具有优越的表／界面活性、低毒性等特点,在医药领域有广阔的应用前景。美国环境保护局的报告认为大鼠口服鼠李糖脂无毒性(LD505000 mg/kg),然而,较多文献发现鼠李糖脂对体外培养的细胞有较大毒性。迄今为止,未见文献解释其大鼠口服是安全的但细胞毒性却比较大的矛盾现象。因此,本文首先采用多种细胞研究鼠李糖脂细胞毒性的产生机理；随后采用静脉注射给药的方式验证鼠李糖脂的体内安全性,并分别用模拟胃液、蛋白结合和基于细胞培养的体外代谢及吸收模型对其体内外毒性差异的原因进行解析。在此基础上,本文进一步采用体外细胞模型评价了其促口服吸收和抗纤维化的作用,开展了鼠李糖脂在医药领域的潜在应用研究。首先,本文采用单层贴壁细胞对鼠李糖脂的细胞毒性进行评价,并阐释了其毒性机理。结果表明,鼠李糖脂对两株癌细胞(HepG2和Caco-2)以及一株正常细胞系(HK-2)呈现类似的毒性：无血清培养基中,单、双鼠李糖脂的最小毒性浓度分别为10和20 mg/L；含10%血清培养基中,单、双鼠李糖脂的最小毒性浓度分别为100和150 mg/L。因此,血清能够有效减弱鼠李糖脂的细胞毒性。本文首次发现,鼠李糖脂将培养基表面张力降低至约41 mN/m以下时产生细胞毒性,而血清通过减缓鼠李糖脂引起的培养基表面张力下降抑制其毒性。采用阴离子化学表面活性剂SDS和SDBS验证培养基表面张力与细胞毒性之间的关系,结果发现它们也在溶液表面张力降至约41 mN/m以下时引起细胞毒性,说明通过降低溶液表面张力导致细胞毒性可能是其共同的细胞毒性机理。其次,本文采用静脉注射给药方式验证了鼠李糖脂在大鼠体内的安全性,并以体外模型解析其体内无显著毒性的原因。与口服相比,鼠李糖脂的静脉注射毒性略高,在1500 mg/kg时引起轻微肝肿大和脾脏淤血,但未发现其它器官毒性。模拟胃酸的结果表明,鼠李糖脂在胃酸中溶解度比较低,为900 mg/L左右；平衡透析法测得鼠李糖脂的蛋白结合率为92%以上；凝胶包埋肝细胞模型预测鼠李糖脂易被肝脏代谢(肝萃取率在65%左右)；小肠细胞模型揭示鼠李糖脂极易被小肠吸收(吸收率为100%)。根据以上体外模型的结果,我们推测鼠李糖脂口服安全的原因可能是：其大部分在胃酸中析出,少部分被小肠吸收进入血液后和血浆蛋白结合,使其血液浓度较低,其易被肝脏代谢的特性又使其血液浓度进一步降低。本文还采用Caco-2细胞模型分别评价了鼠李糖脂对三条小肠吸收途径的影响,考察其促口服吸收的作用。实验发现,150 mg/L的鼠李糖脂分别提高旁路运输药物(酚红)和穿细胞途径药物(普萘洛尔)的表观渗透系数达7.4倍和2倍,而且可以使外排蛋白P-gp的活性下降78%。此外,还发现鼠李糖脂将花青素在Caco-2模型上的渗透系数提高到了1.8-2.6倍。最后,本文采用体外上皮和成纤维细胞模型考察了鼠李糖脂的抗细胞纤维化作用。以TGF-β1分别诱导肺上皮细胞A549和人皮肤成纤维细胞,转化得到肌成纤维细胞,并评价了鼠李糖脂对肌成纤维细胞的特异性毒性。结果表明鼠李糖脂在基本不影响A549及成纤维细胞活率和功能的情况下,对肌成纤维细胞有明显毒性,诱导其凋亡,有效降低其收缩和分泌胶原的能力,且抑制其特异性蛋白α-SMA的表达。综上所述,本文研究了鼠李糖脂的细胞毒性机理,并采用体外模型对其动物体内安全的原因进行了解释,有助于其在医药学领域的应用研究；同时开展了其促口服吸收和抗纤维化的研究,为将其可能作为新药或新型药物助剂奠定了技术基础。
【关键词】：鼠李糖脂 毒性机理 口服促吸收剂 抗纤维化 表面张力
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96;TQ423
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第1章 文献综述13-30
• 1.1 生物表面活性剂鼠李糖脂概述13-16
• 1.1.1 生物表面活性剂及其应用13-14
• 1.1.2 鼠李糖脂概述14-16
• 1.2 鼠李糖脂的安全性及药理作用的研究16-19
• 1.2.1 鼠李糖脂的生物安全性17
• 1.2.2 鼠李糖脂的细胞毒性研究17-18
• 1.2.3 鼠李糖脂药理作用的体内研究18
• 1.2.4 鼠李糖脂药理作用的体外研究18-19
• 1.3 用于新药评价的体外细胞模型19-25
• 1.3.1 药物吸收评价模型20-22
• 1.3.2 药物分布模型22
• 1.3.3 药物代谢评价模型22-23
• 1.3.4 药物排泄评价模型23
• 1.3.5 药物毒性评价模型23-25
• 1.3.6 用于药理研究的细胞模型25
• 1.4 纤维化形成机理和药物抗纤维化研究25-29
• 1.4.1 纤维化的形成机理25-27
• 1.4.2 抗纤维化研究进展27-29
• 1.5 课题的研究思路29-30
• 第2幸鼠李糖脂的细胞毒性及机理研究30-42
• 2.1 引言30
• 2.2 材料与方法30-33
• 2.2.1 实验试剂与仪器30-31
• 2.2.2 细胞培养31
• 2.2.3 细胞活率测定31-32
• 2.2.4 培养基表面张力测定32
• 2.2.5 数据分析32-33
• 2.3 结果与讨论33-41
• 2.3.1 不同血清含量培养基中鼠李糖脂的细胞毒性33-37
• 2.3.2 鼠李糖脂的细胞毒性机理研究37-39
• 2.3.3 采用化学表面活性剂印证鼠李糖脂的细胞毒性机理39-41
• 2.4 本章小结41-42
• 第3章 采用体外模型解析鼠李糖脂体内外毒性差异42-55
• 3.1 引言42
• 3.2 材料与方法42-47
• 3.2.1 实验试剂与仪器42-43
• 3.2.2 细胞培养43
• 3.2.3 大鼠尾静脉注射给药43-44
• 3.2.4 体内器官病理切片检测44
• 3.2.5 鼠李糖脂的HPLC法测定44
• 3.2.6 鼠李糖脂在胃酸中的溶解度测定44
• 3.2.7 鼠李糖脂的血浆蛋白结合率测定44-45
• 3.2.8 溶血实验45
• 3.2.9 鼠李糖脂的双向转运45-46
• 3.2.10 鼠李糖脂的肝细胞代谢能力测定46-47
• 3.2.11 数据分析47
• 3.3 结果与讨论47-53
• 3.3.1 鼠李糖脂的大鼠尾静脉注射毒性评价47-49
• 3.3.2 鼠李糖脂静脉注射呈低毒性的原因解析49-52
• 3.3.3 大鼠口服鼠李糖脂无毒性的原因解析52-53
• 3.4 本章小结53-55
• 第4章 采用细胞模型评价鼠李糖脂作为口服促吸收剂的可行性55-65
• 4.1 引言55
• 4.2 材料和方法55-58
• 4.2.1 实验试剂与仪器55-56
• 4.2.2 细胞培养56
• 4.2.3 药物渗透性研究56-57
• 4.2.4 罗丹明123在Transwell单细胞层上的双向转运能力57
• 4.2.5 罗丹明123和罗丹明110的细胞积累和外排量测定57-58
• 4.2.6 鼠李糖脂促进花青素在小肠的吸收58
• 4.2.7 数据分析58
• 4.3 结果与讨论58-64
• 4.3.1 鼠李糖脂对三种药物吸收途径的作用58-61
• 4.3.2 鼠李糖脂对P-gp外排蛋白活性的抑制作用研究61-64
• 4.4 本章小结64-65
• 第5章 鼠李糖脂抗纤维化的机理研究65-89
• 5.1 引言65
• 5.2 材料与方法65-69
• 5.2.1 实验试剂与仪器65-66
• 5.2.2 成纤维细胞和A549的培养66-67
• 5.2.3 肌成纤维细胞的诱导转化67
• 5.2.4 蛋白印迹(western blot)67
• 5.2.5 细胞活率测定67-68
• 5.2.6 活细胞/死细胞荧光双染(Calcein-AM/PI染色)68
• 5.2.7 腋原浓度测定68
• 5.2.8 胶原收缩实验68
• 5.2.9 细胞凋亡检测68-69
• 5.2.10 免疫荧光染色69
• 5.2.11 数据分析69
• 5.3 结果与讨论69-88
• 5.3.1 A549和成纤维细胞经诱导形成肌成纤维细胞69-72
• 5.3.2 双鼠李糖脂对转化前后细胞毒性的评价72-77
• 5.3.3 双鼠李糖脂诱导转化前后的细胞凋亡77-80
• 5.3.4 双鼠李糖脂抑制肌成纤维细胞的胶原分泌80
• 5.3.5 双鼠李糖脂抑制肌成纤维细胞的胶原收缩80-81
• 5.3.6 鼠李糖脂下调肌成纤维细胞的α-SMA表达81-84
• 5.3.7 其他表面活性剂验证鼠李糖脂抗纤维化机理84-86
• 5.3.8 鼠李糖脂抗细胞纤维化的机理解析86-88
• 5.4 本章小结88-89
• 第6章 结论与展望89-91
• 6.1 总结89-90
• 6.2 不足之处90
• 6.3 展望90-91
• 论文主要创新点91-93
• 参考文献93-115
• 攻读学位期间的科研成果115

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