NF-κB信号通路参与介导的自噬在高血压大鼠心血管重构的作用研究

发布时间：2017-09-12 14:26

  本文关键词：NF-κB信号通路参与介导的自噬在高血压大鼠心血管重构的作用研究

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【摘要】：背景心肌肥厚多是由高血压病造成的,也常见于瓣膜性心脏病,例如主动脉瓣狭窄。早期发生的改变是心脏发生代偿反应,用以增加心排血量；但到后期,则可能成为不可逆转；左心室肥厚最终会导致临床症状的恶化,包括终末期心衰。近年来,对左室肥厚发生发展机制的研究已经有了新的认识,目前认为心肌肥厚是一个十分复杂的病理过程,所涉及的信号传导途径已经是心血管研究领域的热点问题之一。已有实验证明氧化应激产物ROS在心肌肥厚中起重要的作用。氧化应激信号通路中重要的是NF-κB通路。ROS产生和消除的失衡会导致代谢产物增加和营养的缺乏,继而可以导致自噬发生。左室肥厚促使蛋白质在左心室聚合,当存在这样的外部压力时,我们认为自噬会作为一个重要的生存机制发挥着作用。我们已知,自噬是一个高度保守的细胞过程,负责清除或回收寿命长的蛋白质和细胞器,它还可提供给其它细胞二次利用的营养,包括细胞内蛋白质和细胞器。这种行为可以为细胞提供能量。然而,在某些情况下,自噬可能是有害的,因为自噬的吞噬作用产生细胞损害。当前对于自噬在心肌肥厚中的作用有许多研究,但是其作用究竟是有益还是有害目前还不清楚,其中具体的机制亦不清楚。吡咯烷二硫代氨基甲酸脂(pyrrolidine dithiocarbamate)PDTC作为NF-κB的特异性抑制剂,主要是通过抑制IK β的降解,以此减少NF-κB的核移位来抑制NF-κB的活性。以往对于心肌肥厚的动物模型多集中在给予动物做降主动脉缩窄等进行研究。主动脉缩窄后可以产生心肌肥厚。但是手术本身也会产生应激等损害,对于评价自噬带来不确定的因素。实验研究心肌肥厚的动物模型还有药物刺激,转基因动物等,这些其他动物模型也是有各种缺陷。所以我们选择动物模型为自发性高血压大鼠。那么自噬在自发性高血压大鼠心肌组织中的表达会是什么样呢?在自发性高血压大鼠心肌肥厚过程中,心肌氧化应激程度变化如何?自噬在自发性高血压肥厚心肌表达的方式通过何种信号通路呢?ROS和氧化应激如何影响自噬呢?这与氧化应激主要的NF-κB信号通路相关性如何呢?目前国内外学者还没有对此展开研究。目的1.探讨应用核磁影像技术观察自发性高血压大鼠的左室变化,心功能变化；2.探讨自噬及氧化应激在自发性高血压大鼠心肌肥厚时期的心肌组织中的活性表达；探讨自发性高血压大鼠时期的心肌组织的自噬活性表达与左室肥厚、心肌纤维化以及氧化应激的相关性。初步研究自噬与线粒体变化的关系。3.探讨自噬在自发性高血压大鼠活性表达的趋势原因及可能的信号通路以及与NF-κB信号通路的相关性。探讨NF-κB p65信号通路在心肌肥厚中自噬中的作用及分子机制方法对4月大的SHR和WKY大鼠各14只进行喂养,其中7只SHR和7只WKY应用吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)治疗,时间为16周。其余7只SHR和7只WKY继续普通喂养。老鼠被分为4组：1)WKY大鼠(WKY)2)SHR(SHR)和3)SHR应用PDTC(SHR+PDTC),4) WKY应用PDTC(WKY+PDTC)。PDTC饮用的剂量105毫克／公斤/天。在给予PDTC进行了16周结束时,动物被用于血压测量和试验研究。所有实验都是在遵守山东大学的实验动物使用指导方针和协议。进行以下实验：(1)各组大鼠测量体重,测量尾动脉血压。做血液生化检查。(2)处死前开始前进行核磁共振检查,测定舒张末期左室内径(LVEDd)、舒张末期室间隔的厚度(IVSd)、舒张末期左室后壁的厚度(LVPWd)、左室收缩末期面积(LVSA)、左室舒张末期面积(LVDA)、左室质量(Lvmass)、收缩末期容积(ESV)、舒张末期容积(EDV)、左室射血分数(LVEF)。(3)做心肌组织超微结构和病理学检查,HE检查。(4)检测氧化应激指标MDA。(5)电镜检查检测自噬的表达及与心肌肥厚各项指标相关性。(6)心肌MASSON检查分析心肌胶原比及与自噬的相关性。(7)免疫组化检查检测各组大鼠自噬的表达及与心肌肥厚各项指标相关性。(8)半定量PCR检查检测自噬的表达及与心肌肥厚指标相关性。(9) Westen blot法检测自噬的表达及与心肌肥厚各项指标相关性。Western blot法检测自噬信号表达的通路。Westen blot法检测NF-K B信号通路的相关性。结果1.实验动物基本情况：实验过程中共有3只大鼠死亡,WKY大鼠组一只,SHR大鼠组二只。在普通喂养内死亡。其他组无死亡。共25只大鼠完成实验。2.各组大鼠基本指标比较喂养前,与WKY对照组比较, SHR大鼠组尾动脉收缩压升高,差异有意义(P0.05)：喂养后,WKY组较前血压上升,但是SHR组尾动脉收缩压较WKY对照组明显升高,有显著性差异(P0.01), (P0.05)。SHR+PDTC组相比未经处理的SHR组血压低30毫米汞柱。表明SHR+PDTC组呈显著降低舒张压和收缩压。WKY组与WKY+PDTC组组间比较无明显变化。3.核磁共振检查由专人采用荷兰philipe3.0T核磁共振仪,测取连续3个心动周期的舒张末期室间隔的厚度(IVSd)、舒张末期左室后壁的厚度(LVPWd)、左室收缩末期面积(LVSA)、舒张末期左室内径(LVEDd)左室舒张末期面积(LVDA)、左室质量(Lvmass)、收缩末期容积(ESV)、舒张末期容积(EDV)、左室射血分数(LVEF)取其均值。LVEF各组没有显著性差异。SHR组IVSd、PWT、LVM、LVMI均较WKY明显升高,有显著性差异(P0.01),与SHR+PDTC组比较示以上结果有增高。WKY组与WKY+PDTC组IVSd、PWT、LVM、LVMI值两组间比较无明显差异,与SHR组、SHR+PDTC组比较有明显差异(P0.05)。4.心肌组织病理观察HE染色显示：WKY组、WKY+PDTC组心肌细胞体积较小,形态较均匀,排列较整齐；SHR组心肌细胞较其他组体积变大,形态呈现不规则,排列紊乱；细胞壁不完全清楚,细胞连接处可见融合现象。SHR+PDTC组与SHR组比较示细胞体积无区别,但是细胞形态较后者规则,排列无紊乱。SHR+PDTC组与WKY组、WKY+PDTC组比较细胞体积较大。5.心肌纤维化定性及定量分析Masson染色胶原含量的检测：WKY组心肌纤维排列整齐,心肌内冠状动脉周围有少量胶原沉积,心肌间质内胶原多呈长条状分布；SHR组与WKY组比较,心肌细胞肿大,肌纤维排列紊乱,心肌冠状动脉周围及心肌间质胶原显著增多,而且呈现交联状。WKY组心肌细胞肿大的现象明显减少。SHR+PDTC组与SHR组比较,前者血管周围及心肌间质胶原有所减少。定量分析测量心肌胶原容积分数(CVF)和心肌内血管周围胶原面积(PVCA)。与WKY组相比,SHR组左室心肌组织胶原含量明显升高(P0.01)。WKY组与WKY+PDTC组比较,左室心肌组织胶原含量无明显区别。SHR+PDTC组与SHR组比较,前者心肌胶原含量有减少。6.氧化应激指标检测SHR组明显高于WKY组、WKY+PDTC组、SHR+PDTC组。WKY组与WKY+PDTC组比较无明显区别。SHR+PDTC组高于WKY组、WKY+PDTC组。7.免疫组化检查检测自噬的表达及与心肌肥厚各项指标相关性。与WKY对照组相比,SHR组大鼠心肌组织中自噬表达明显升高(P0.01)；SHR组自噬表达水平也高于SHR+PDTC组、WKY+PDTC组(P0.01)。WKY组与WKY+PDTC组大鼠比较没有显著性变化。SHR组自噬表达与IVST、LVM、LVMI呈明显的正相关(r=0.74,P0.01)。8.半定量PCR检查检测自噬的表达及与心肌肥厚各项指标相关性。与WKY对照组相比,SHR组大鼠心肌组织中自噬表达明显升高(P0.01)；SHR组自噬表达水平也高于SHR+PDTC组、WKY+PDTC组(P0.01)。WKY组与WKY+PDTC组大鼠比较没有显著性变化。9.电镜检查检测自噬的表达及与心肌肥厚各项指标相关性。与WKY和SHR+PDTC对照组相比,SHR组大鼠的电镜切片观察结果示自噬泡明显增多趋势,WKY组与WKY+PDTC组比较,电镜切片自噬泡无明显变化。10. Westen blot检测各组心肌组织中自噬的表达与WKY对照组相比,SHR组大鼠心肌组织中LC3-I/LC3-Ⅱ表达明显升高(P0.01)：与WKY对照组相比,WKY+PDTC组大鼠的LC3-I/LC3-Ⅱ没有显著性变化。SHR组LC3-I/LC3-Ⅱ表达与IVST、LVM、LVMI呈明显的正相关(r=0.74,P0.01)。Western blot测定AKT、AMPK、S6K、mTOR的表达；与WKY对照组相比,SHR组大鼠心肌组织中表达明显升高(P0.01); SHR组表达水平也高于SHR+P组、WKY+P组(P0.01)。WKY组与WKY+P组大鼠比较没有显著性变化。Western blot测定NF-κ Bp65的表达：与WKY对照组相比,SHR组大鼠心肌组织中NF-κ Bp65的表达明显增高。(P0.01);SHR组表达水平也高于SHR+PDTC组、WKY+PDTC组(P0.01). WKY组与WKY+PDTC组大鼠比较没有显著性变化。结论1.核磁共振结果显示SHR大鼠心肌肥厚形成,心脏腔径发生变化,心肌明显纤维化。作为研究心肌肥厚动物模型,我们采用核磁共振检查方法为心肌肥厚左室重构的研究奠定了基础。2.自发性高血压大鼠心肌组织中自噬表达升高,且与心肌肥厚相关指标呈明显正相关,提示自噬参与了自发性高血压大鼠心肌肥厚的病变过程。其中,氧化应激指标检测示MDA在SHR组明显增高。3.自发性高血压大鼠心肌组织纤维化与自噬有相关性。各种检测方法的综合应用,其中电镜检查可作为明显可靠的标准。对线粒体的测量数据表明自噬与线粒体的变化密切相关。4. NF-κ Bp65信号通路有在心肌肥厚中的激活自噬作用。5. PDTC通过抑NF-κB通路抑制氧化应激,同时抑制自噬。这似乎可以提示我们自噬在心肌肥厚一定阶段中的作用并不是保护,而是相反。背景主动脉重构是一系列复杂的分子及细胞学的改变引起的主动脉结构及功能的重要变化,这些变化主要包括:主动脉重构的结构改变,表现为管腔的扩大,血管壁X椇窦肮芮患负喂剐偷母谋洹：艘蜃，

本文编号：837770