FTY-720P联合同种异体骨治疗骨缺损相关机制的研究

发布时间：2017-09-14 00:21

  本文关键词：FTY-720P联合同种异体骨治疗骨缺损相关机制的研究

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【摘要】：研究背景随着社会经济水平的进步和发展,各种原因引起的骨缺损在临床上越来越常见,目前临床上常见的引起骨缺损的原因如：骨肿瘤、创伤等,造成了严重的后果,尤其是由于上述原因导致的大段骨缺损,治疗修复效果差,对社会及患者本人造成了重大的负担,因此骨缺损的修复成为临床上函需解决的重要课题。目前主流的针对骨缺损的修复多采用移植物填充的方法,而移植物需要具有至少两种特性即：骨传导及骨诱导作用。骨传导作用是指提供良好的三维支架,骨诱导作用包括BMP,VEGF和TGF-β等诱导血管或成骨细胞功能的特殊的活性因子的作用。根据上述两种特性,目前在临床上及实验室中进行的骨缺损填充方法主要有三种：即自体骨移植,异体骨移植,以及新兴生物学材料如：纳米壳聚糖、珊瑚石等,在这些方法中,自体骨组织相容性好,并发症少,但其来源有限,限制了其在治疗的范围；而新兴生物材料由于其具体的并发症尚不清楚,因此尚未在临床上得到广泛应用。因此同种异体骨成为目前临床上解决骨缺损修复的重要材料。相比自体骨,虽然来源较多,数量充足,能够满足对各种类型的骨缺损进行填充,但由于其具有免疫原性,因此在临床上应用时容易产生多种并发症：如移植异体骨坏死、局部炎症反应等问题,影响了其治疗效果。如何在不影响异体骨骨传导及骨诱导作用的前提下减轻排斥反应,减少移植异体骨引起的免疫学并发症成为临床上函需解决的重要课题。同种异体骨引起的免疫排斥反应原因极其复杂,因此临床上常规采用一些方法如更新制作同种异体骨工艺、组织配型等,此类方法往往受到技术以及经济的限制,不能广泛推广应用,而通过应用免疫抑制剂的方式,不仅可以有效的减轻免疫反应,在技术和经济上较易于实现,以便推广应用,同时有些免疫抑制剂还能起到促进骨缺损修复的作用,可以作为临床上治疗骨缺损的研究方向。FTY-720(芬戈莫德,fingolimod)是自冬虫夏草中提取的一种成分,并于实验室中经过改变侧链等过程后合成,于2010年9月份通过美国FDA认证,并作为新型免疫抑制剂用于临床上多种免疫系统疾病。其主要活性成分是在体内经过磷酸化修饰后变成FTY-720P产生作用,其主要通过如：影响淋巴细胞迁移、影响如树突状细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞等天然免疫细胞起作用。同时该药物对成骨也有重要的影响,国内外学者采用各种材料复合FTY-720进行动物实验,均取得了不错的治疗效果,但其具体机制尚不明确,因此需要进一步的研究和探索。实验目的1、通过骨缺损动物实验,并通过影像学评分、骨密度检查及组织学检查以验证FTY-720P联合同种异体骨治疗骨缺损的效果,进一步通过荧光定量PCR初步推测其可能的治疗机制。2、通过体外两种方式的破骨细胞培养,同时进行破骨细胞计数及破骨细胞吞噬骨片后骨陷窝计数的方式,分析FTY-720P对破骨细胞形成及其吞噬功能的影响,后通过蛋白芯片的方式,检测应用FTY-720P和无FTY-720P破骨细胞中蛋白表达差异,推测其可能的机制,从而为下一步进行组织工程学实验奠定理论基础。实验方法1、同种异体骨的制备：解剖完整取出新西兰大白兔四肢长骨,采用深冻法去除其抗原性,将制备好异体骨真空包装后,以25kGy钴60辐照灭菌并置于4℃恒温冰箱内保存。2、建模及分组：采用Girolamo等方法,选用成年新西兰大白兔,体重在2.0kg～3.0kg范围内,性别不限,建立新西兰大白兔胫骨单侧皮质缺损模型,然后进行随机分组,随机抽取12只为单纯骨缺损组,12只为单纯同种异体骨移植治疗组,12只为单纯自体骨移植对照组,12只为FTY-720P联合同种异体骨治疗组。3、影像学检查及Lane-Sandhu影像学评分：分别于术后2周,4周,8周,12周采用耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠,按照1 ml/kg麻醉实验动物,效果满意后首先进行X线影像学检查,并通过三名熟悉Lane-Sandhu影像学评分标准的实验人员进行评分,并记录结果。4、骨密度检测：分别于术后2周、4周、8周和12周,于各组中选取一只动物,采用耳缘静脉注射空气的方法处死动物后,于骨密度仪上测量骨缺损区的骨密度相对值。5、组织标本大体肉眼观察及HE染色观察：于术后2周、4周、8周和12周采用耳缘静脉注射空气法处死动物,首先进行脱钙处理,效果满意后进行常规HE染色处理,并于光镜下观察标本HE染色情况。6、荧光定量PCR检测：于术后2周、4周、8周和12周采用耳缘静脉注射空气法处死动物,取标本进行SPP-1, BMP-2, VEGF, Col Ⅰ α1及S1P受体表达情况的荧光定量PCR检测。7、RAW264.7诱导破骨细胞形成及鉴定：采用单独应用RANKL诱导RAW264.7细胞的方法,以不同浓度的RANKL即10、25、50、100ng/ml的浓度对细胞进行培养,同时对不同代数的RAW264.7细胞分别进行诱导,观察RANKL最佳浓度及最佳的实验用细胞代数。破骨细胞的鉴定：通过对细胞核计数以及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色阳性鉴定RAW264.7细胞诱导破骨细胞的情况。8、FTY-720P对RAW264.7细胞诱导成为破骨细胞的影响：首先加入最佳浓度RANKL,后按照FTY-720P添加浓度的不同分为：0、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500ng/ml浓度组,于恒温箱内孵育4天后进行显微镜下观察细胞形态及细胞核数目,并按照破骨细胞鉴定的方法进行破骨细胞的鉴定及观察药物对破骨细胞形成的影响。9、BMMs获取、诱导破骨细胞及鉴定：取1月龄大鼠四肢肱骨、股骨、胫骨主干,以BMMs培养液反复冲洗骨髓腔细胞至细胞培养皿中,并加入10ng/ml M-CSF并置入无菌新鲜牛骨切片恒温培养约72小时后,添加30ng/ml RANKL。培养约7天后,通过对细胞核计数以及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色阳性鉴定BMMs细胞诱导破骨细胞的情况。10、FTY-720P对BMMs诱导破骨细胞形成及吞噬功能的影响：根据加入FTY-720P的浓度不同,将上述培养皿分为0、500、600、700、800、900、1000、1500ng/ml浓度组于培养10天后,分别进行TRAP酶和F-actin染色,观察FTY-720P对BMMs诱导破骨细胞数目的影响。后进行甲苯胺蓝染色,计数骨片上骨陷窝数目,评价不同浓度FTY-720P对骨吞噬能力的影响。11、FTY-720P对BMMs诱导破骨细胞蛋白芯片研究：根据是否添加700ng/ml FTY-720P,分成实验组与对照组。按照Raybiotech试剂盒说明,对两组提取蛋白后进行蛋白芯片实验,分析两组表达的差异蛋白。实验结果：1、影像学检查及Lane-Sandhu影像学评分影像学检查提示：自术后2周到术后12周,除术后第2周组外,术后第4、8、12周组采用FTY-720P联合同种异体骨治疗骨缺损组骨愈合效果与单纯采用自体骨组效果相当,并优于单纯同种异体骨移植对照组和空白组。Lane-Sandhu影像学评分,采用结果提示：术后2周各组经单因素方差分析,F=0.257,P=0.854。因P0.05,无统计学意义。术后4周各组经单因素方差分析,F=170.469,P0.001。采用SNK对多个样本均数间进行两两比较,按a=0.05水准,可认为实验组(3.67±0.14)与自体骨移植对照组(3.97±0.17)评分高于同种异体骨移植对照组(3.07±0.26),同种异体骨移植对照组(3.07±0.24)高于空白组(0.63±0.24),但尚不能认为实验组与自体骨移植对照组评分均数有统计学意义(P=0.109)。术后8周各组经单因素方差分析,F=30.655,P0.001。采用SNK对多个样本均数间进行两两比较,按α=0.05水准,可认为实验组(5.73±±0.77)、单纯自体骨移植对照组(6.16±0.34)及单纯同种异体骨移植对照组(5.19±0.29)评分高于空白组(1.64±0.94),但尚不能认为实验组与两组对照组评分均数有统计学意义(P=0.218)。术后12周各组单因素方差分析,F=69.152,P0.001。采用SNK对多个样本均数间进行两两比较,按α=0.05水准,可认为实验组(7.93±±0.57)、单纯自体骨移植对照组(8.76±±0.64)与单纯同种异体骨移植对照组(6.99±0.37)评分高于空白组(2.36±0.74),且自体骨移植对照组(8.76±±0.64)评分大于单纯同种异体骨移植对照组(6.99±0.37),但尚不能认为实验组与自体骨移植对照组(P=0.126)、实验组与同种异体骨对照组(P=0.089)评分均数有统计学意义。2、骨密度检测术后2周各组骨密度结果进行单因素方差分析,F=98.359,P0.001。采用SNK对多个样本均数间进行两两比较,按a=0.05水准,可认为自体骨移植对照组(0.64±0.02)大于实验组(0.60±±0.02),实验组(0.60±±0.02)大于单纯同种异体骨对照组(0.47±0.02),三组均大于空白组(0.40±0.02)。术后4周各组骨密度结果进行单因素方差分析,F=13.370,P=0.002。采用SNK对多个样本均数间进行两两比较,按a=0.05水准,可认为实验组(1.24±0.03)、单纯自体骨移植对照组(1.30±0.05)与单纯同种异体骨移植对照组(1.19±0.02)相对骨密度值高于空白组(1.00±0.10),但尚不能认为实验组与两组对照组相对骨密度的均数之间有统计学意义P=0.138。术后8周各组骨密度结果进行单因素方差分析,F=21.433,P0.001。采用SNK对多个样本均数间进行两两比较,按a=0.05水准,可认为实验组(1.35±0.05)、单纯自体骨移植对照组(1.42±±0.04)与单纯同种异体骨移植对照组(1.30±±0.02)相对骨密度值高于空白组(1.09±0.08),但尚不能认为实验组与两组对照组相对骨密度的均数之间有统计学意义P=0.066。术后12周各组骨密度结果进行单因素方差分析,F=33.971,P0.001。采用SNK对多个样本均数间进行两两比较,按a=0.05水准,可认为实验组(1.51±0.07)、单纯自体骨移植对照组(1.60±0.03)与单纯同种异体骨移植对照组(1.50±0.04)相对骨密度值高于空白组(1.17±0.07),但尚不能认为实验组与两组对照组相对骨密度的均数之间有统计学意义P=0.148。3、组织标本大体肉眼观察及HE染色观察术后2周各组均可见血性及炎症细胞渗出,其中自体骨移植对照组及实验组炎症渗出相对较其他两组少,并可见移植骨残留；术后4周,空白组炎症细胞较前渗出增加,而其他各组炎症细胞渗出均较前减少,同时仍旧可见移植骨残留,移植骨周围可见炎症细胞围绕；术后8周,各组中血性及炎症细胞渗出较前明显减少,各组均呈现出修复状态,预实验组及自体骨移植对照组相比,同种异体骨移植对照组可见其修复部位骨排列紊乱；术后12周,各组恢复情况不同,空白组可见于两断端部分主要以肉芽组织填充为主,而自体骨移植对照组恢复好,同种异体骨移植对照组仍旧骨小梁排列紊乱,实验组中仍旧可见少量同种异体骨残留。4、荧光定量PCR结果：通过RT-PCR检测,结果提示术后2周,BMP-2和VEGF的表达均表现为单纯同种异体骨移植对照组与实验组大于自体骨移植对照组,而Col Ⅰ α1的表达表现为自体骨移植对照组与实验组大于同种异体骨移植对照组,Spp-1、SIP受体表达三组之间差异无明显统计学意义。术后4周,BMP-2、Spp-1和VEGF的表达表现为单纯同种异体骨移植对照组与实验组大于自体骨移植对照组,而Col Ⅰ α1和S1P受体表达表现为三组之间差异无统计学意义。术后8周,VEGF、 Col Ⅰ α1和S1P受体表达表现为自体骨移植对照组与实验组大于单纯同种异体骨对照组,而BMP-2和Spp-1的表达量三组之间差异无统计学意义。术后12周,BMP-2表达表现为单纯同种异体骨对照组与实验组表达量大于单纯自体骨移植对照组,Spp-1和VEGF表达表现为三组差异无统计学意义,而Col Ⅰ α1与S1P受体表达表现为自体骨移植对照组表达量大于单纯同种异体骨对照组与实验组。5、RAW264.7诱导破骨细胞细胞形态学改变形态学观察：未加入RANKL刺激的RAW264.7细胞,可见细胞呈贴壁生长,并可见细胞老化形成梭形或不规则形状,未见多核细胞；而加入RANKL刺激的RAW264.7细胞,可见多核巨细胞生成,并可见细胞周围有细小伪足形成。6、最佳诱导RAW264.7成为破骨细胞RANKL浓度的确定通过计数经TRAP酶染色后破骨细胞阳性率的情况,结果提示：经完全随机设计方差分析,F=58.105,P0.001。采用多个样本均数间两两比较的SNK-t检验,按照α=0.05水准,可认为以50ng/ml(8.11±0.41)与100ng/ml(7.34±0.70)的RANKL浓度培养出破骨细胞的阳性率大于10ng/ml(4.02±0.23)与25ng/ml(5.10±0.19)浓度培养出的破骨细胞阳性率,其中25ng/ml(5.10±0.19)浓度培养出的破骨细胞阳性率大于10ng/ml(4.02±0.23)浓度培养出的破骨细胞阳性率,而50ng/ml(8.11±0.41)与100ng/ml(7.34±0.70)的RANKL浓度培养出破骨细胞的阳性率差异无统计学意义(P=0.061)。7、最佳RAW264.7诱导破骨细胞细胞代数的确定通过计数经TRAP酶染色后破骨细胞阳性率的情况,结果提示：经完全随机设计方差分析,F=61.064,P0.001,按照a=0.05水准,可认为不同代数RAW264.7细胞诱导破骨细胞阳性率不同,经过多个样本均数间两两比较的SNK-t检验,按照a=0.05水准,可认为第8(9.32±0.62)、12(8.76±0.51)、16(7.92±0.32)代RAW264.7细胞诱导破骨细胞的阳性率大于第4代(4.944±1.02),第4代(4.94±1.02)RAW264.7细胞诱导破骨细胞的阳性率大于第24代(2.07±0.70)破骨细胞阳性率,而第8(9.32±0.62)、12(8.76±0.51)、16(7.92±0.32)代RAW264.7细胞诱导破骨细胞的阳性率差异无统计学意义(P=0.069)。8、不同浓度FTY-720P对RAW264.7细胞诱导形成破骨细胞的影响通过计数经TRAP酶染色后破骨细胞阳性率的情况,结果提示：经完全随机设计方差分析,F=250.638,P0.001,按照a=0.05水准,可认为不同浓度FTY-720P导致RAW264.7细胞诱导破骨细胞阳性率不同,经过多个样本均数间两两比较的SNK-t检验,按照a=0.05水准,可认为无添加FTY-720P(9.37±0.54)和添加浓度为500(9.02±0.49)、600ng/ml(8.89±0.60)组诱导破骨细胞阳性率大于添加700ng/ml (7.72±0.41)FTY-720P组,而700ng/ml(7.72±0.41)FTY-720P组诱导破骨细胞阳性率大于添加800(3.30±0.48)、900ng/ml(2.80±0.52)FTY-720P组,而1000(1.22±0.39)、1500(0.47±0.16)、2000(0.42±0.19)、2500ng/ml(0.56±0.22) FTY-720P组破骨细胞阳性率最低(P=0.377)。9、BMMs细胞诱导及FTY-720P对诱导破骨细胞影响自骨髓中提取出的BMMs,细胞多成圆形或多角形,并可见少量细胞呈现梭形,细胞以单个细胞核细胞为主,未见多个核细胞。加入M-CSF和RANKL诱导24小时后,部分细胞出现梭形改变,并逐渐坏死并漂浮在培养液表面；诱导培养至第4天后,培养基中出现少量体型较大细胞,并可见细胞呈多核,并伸出触角；至第7天,培养集中可见数量较多的多核巨细胞,细胞生长出较多伪足,经TRAP酶染色及F-actin染色,证明该种巨型多核细胞为破骨细胞。10、FTY-720P对BMMs细胞诱导成的破骨细胞吞噬功能的影响通过采用甲苯胺蓝染色后,对每张骨片上的陷窝数进行计数,结果提示：经完全随机设计方差分析,F=68.173,P0.001,按照a=0.05水准,可认为不同浓度FTY-720P导致BMMs细胞诱导破骨细胞吞噬骨片功能不同,经过多个样本均数间两两比较的SNK-t检验,按照a=0.05水准,可认为无添加FTY-720P(147.58±13.27)和添加浓度为500(136.21±12.71)、600ng/ml(129.93±10.68)组诱导出破骨细胞吞噬骨片后形成的陷窝数大于添加700ng/ml(96.47±13.11)FTY-720P组,而700ng/ml(96.47±13.11)FTY-720P组诱导出破骨细胞吞噬骨片后形成的陷窝数大于添加800(47.32±14.59)、900ng/ml(31.13±9.08)FTY-720P组,而800(47.32±14.59)、900(31.13±9.08)、1000(19.79±8.41)、1500ng/ml(19.03±8.95)FTY-720P组诱导出破骨细胞吞噬骨片后形成的陷窝数之间差别无统计学意义(P=0.180)。11、FTY-720P对BMMs细胞诱导成的破骨细胞蛋白芯片的研究根据有无添加700ng/mlFTY-720P将细胞分为实验组和对照组,其中实验组有FTY-720P添加,而对照组无FTY-720P添加,进行蛋白芯片实验后,结果提示：(1)白介素、肿瘤坏死因子、转化生长因子家族蛋白、MMP类蛋白、趋化因子等蛋白表达在对照组及实验组中存在差异；(2)IL-4、IL-6、IL-12、MMP-2、 VEGF-C及GFR alpha-1、碱性FGF、MIP-2在实验组中表达较高。实验结论1、通过影像学检查、影像学评分、骨密度检查及HE染色观察结果提示同种异体骨复合FTY-720P能够取得和自体骨移植相近的修复骨缺损的效果。2、通过荧光定量PCR实验,并不能准确阐明FTY720P联合同种异体骨治疗骨缺损的具体治疗机制,仅能提示可能与BMP-2、VEGF和Spp-1表达有关,因此需要进一步进行细胞实验阐明FTY720P具体作用机制。3、通过计数经TRAP酶染色后破骨细胞阳性率的情况,明确了RAW264.7细胞最佳的诱导破骨细胞的细胞代数及最佳的诱导其形成破骨细胞的RANKL浓度,并证明FTY-720P可以有效抑制RAW264.7诱导成为破骨细胞。4、通过TRAP酶和F-actin染色由BMMs诱导破骨细胞及甲苯胺蓝染色后计数由BMMs诱导成为破骨细胞后吞噬骨片的骨陷窝实验,证明FTY-720P可以降低由BMMs诱导破骨细胞的数目及吞噬骨片功能。5、通过蛋白芯片研究,结果提示FTY-720P极有可能通过高表达IL-4,降低IL-1、3的表达,控制破骨细胞的形成及功能,具体机制本实验尚不能证明,需要继续进行成骨细胞的实验及进一步的蛋白实验来阐述其治疗机制。
【关键词】：FTY-720P 同种异体骨 RAW264.7细胞 BMMs细胞 破骨细胞 蛋白芯片
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R687
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-26
• 前言26-33
• 参考文献29-33
• 第一部分 FTY-720P联合同种异体骨移植治疗骨缺损效果的动物实验研究33-81
• 一、引言33
• 二、材料和方法33-42
• 三、结果42-72
• 四、讨论72-77
• 参考文献77-81
• 第二部分 FTY-720P对体外诱导破骨细胞分化及功能的影响81-129
• 一、引言81
• 二、材料和方法81-90
• 三、结果90-119
• 四、讨论119-124
• 参考文献124-129
• 综述129-148
• 参考文献140-148
• 全文总结148-149
• 攻读学位期间成果149-150
• 中英文缩略词对照表150-152
• 致谢152-154
• 统计学证明154

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本文编号：846766