齐墩果酸通过胆汁酸受体TGR5减肥作用的分子机制研究

发布时间：2017-09-15 09:48

  本文关键词：齐墩果酸通过胆汁酸受体TGR5减肥作用的分子机制研究

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【摘要】：超重和肥胖已被全世界公认为一种慢性疾病。而且肥胖的发病率已呈急剧的上升趋势。增加能量消耗是最安全、最有前景的非手术减肥的方法。G蛋白偶联受体(TGR5)同法尼酯受体(FXR)同属胆汁酸受体,共同调节胆汁酸的动态平衡和信号通路,都能调节糖代谢。脂肪分为白色脂肪(WAT)和褐色脂肪(BAT),WAT贮存能量,BAT以产热的方式消耗能量。TGR5在褐色脂肪(BAT)中的线粒体上高表达,通过胆酸-TGR5-CAMP-D2-T3-UCP通路导致ATP合成降低,从而调节能量代谢的动态平衡达到减肥效果。齐墩果酸(OA)是TGR5天然植物配体,原用为治疗肝炎药物,后发现OA可使高脂饮食的动物体重下降,能提高糖耐,但与TGR5关系不清楚。近来,mi RNAs作为人类疾病潜在的治疗新靶标得到了大量的关注。其中,mi R-26a能够阻止肥胖诱导的胰岛素抵抗及肝脏过多合成脂质,表明mi R-26a可作为提高胰岛素敏感性及抑制脂质、糖合成的潜在新靶标。本研究通过建立肥胖小鼠的动物模型,探索天然植物药齐墩果酸(OA)是否且如何通过褐色脂肪中高表达的TGR5受体调节能量代谢,消耗能量达到减肥效果作用的分子机制。通过本研究我们得出如下结果:TGR5对于OA调节肥胖与糖耐受是必要的通过野生型及TGR5-/-小鼠分组后喂养普通食物、高脂食物及OA,二十周后取标本测量各项指标及葡萄糖糖耐量实验和胰岛素抵抗实验,RT-PCR实验等,数据表明OA在体外能够激活TGR5,从而控制小鼠体重及降低高血糖。给予OA干预,动物体重可下降至普通饮食组水平。然而,尽管OA能够显著减少高脂饮食组小鼠体重,但与普通饮食组仍存在较大差异。通过测量内脏脂肪,结果显示OA在高脂饮食动物体脂形成中有着相似的作用。这进一步证实OA能够减少野生型小鼠体脂的聚积,但这种作用在TGR5-/-小鼠身上不能得以体现。这些结果明确指出TGR5能够调节OA诱导的减肥效应。OA对TGR5-/-小鼠也有些微功效,这归因于OA对FXR或其他蛋白质有着轻微的激活作用。接着,我们对比了野生组与TGR5-/-组小鼠的糖耐量。正如所料,两组小鼠经HFD喂养均引起糖耐量增高。而经过OA治疗,可显著提高野生组小鼠、而非TGR5-/-小鼠的糖耐量,表明OA提高糖耐具有TGR5依赖性。TGR5的激活可增加mi R-26a表达将OA作为一种工具来筛选可被TGR5激活调节的下游肝脏miRNAs。在我们研究的这些mi RNAs中,mi R-26a能够被OA显著上调,但这种上调效应只存在于野生型小鼠,不存在于TGR5-/-小鼠。相比之下,mi R-16a并不受OA或TGR5状态的影响。CA显著上调mi R-26a的表达水平。CA对mi R-26a表达的影响并无FXR依赖性。TGR5的激活上调巨噬细胞中mi R-26a表达用TGR5激动剂OA处理RAW264.7细胞、Kupffer细胞。结果表明TGR5的激活确实能够诱导巨噬细胞系及Kupffer细胞中mi R-26a的表达,证明了TGR5在上调巨噬细胞中mi R-26a表达的新功能。而Kupffer细胞中一些其他mi RNAs,包括mi R-16,mi R-21及mi R-126,则不会受OA的影响。同时,其他细胞系经OA处理后对mi R-26a的表达没有影响。JNK信号通路与TGR5诱导mi R-26a表达下游信号相关在RAW264.7及Kupffer细胞中经OA处理后JNK磷酸化作用迅速增强。OA刺激可增强野生型小鼠腹腔巨噬细胞中JNK氧化磷酸化水平,TGR5-/-小鼠并无此效应。这些结果提示JNK只有在TGR5激活后才会被特异性激活。我们进一步研究了抑制JNK信号通路是否会阻断TGR5依赖性促炎性细胞因子的诱导。给予JNK诱导剂SP600125(10μM),可显著减少RAW264.7细胞中OA诱导的mi R-26a转录。甚至,在CA喂养的正常小鼠肝脏中,mi R-26a的诱导是增加的,而在JNK1-/-小鼠肝脏该诱导受损。这些结果表明JNK为肝脏中TGR5调节细胞因子产生的关键下游作用分子。启动子分析确定了OA的反应DNA序列位于mi R-26a近侧端我们还把TGR5反应的DNA元件定位在mi R-26a前体的近侧端,此处与宿主基因的转录无关。这些结果将首次阐述TGR5调节mi R-26a表达的新机制,同时将胆汁酸信号调节代谢作用与mi RNAs调节通路联系起来。总之,当前的研究证明OA可以通过TGR5调节能量代谢达到减肥的效果,其可以通过JNK依赖途径增加mi R-26a表达。因而,我们的研究结果提供了胆汁酸信号和mi RNAs之间在代谢调解中一种新的联系。这些发现还表明,通过小分子激活TGR5可以调节mi RNAs的表达,以治疗肥胖相关代谢疾病。
【关键词】：G蛋白偶联受体 mi R-26a 肥胖 齐墩果酸 肝脏
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R589.2
【目录】：

• 英文缩略词表4-5
• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-21
• 参考文献15-21
• 引言21
• 材料与方法21-53
• 1.实验材料21-27
• 1.1 实验动物与饲料21-22
• 1.2 实验试剂与药品22-23
• 1.3 试剂配制23-25
• 1.4 主要仪器设备、器械25-26
• 1.5 实验组分组与干预26-27
• 2.实验方法27-31
• 2.1 肥胖小鼠模型的建立（OA对肥胖小鼠饮食的干预）27-28
• 2.2 第二批肥胖小鼠模型的建立（TGR5其他种类配体对肥胖小鼠饮食的干预）28-29
• 2.3 OA干预后胰岛素抵抗实验的检测29
• 2.4 其他TGR5的不同配体干预后胰岛素抵抗实验的检测29-30
• 2.5 OA干预后血脂（甘油三酯，，磷脂及胆固醇），肝脏重量的检测30
• 2.6 其他TGR5的不同配体干预后血脂（甘油三酯，磷脂及胆固醇），肝脏重量的检测30-31
• 3.各实验方法操作步骤31-53
• 3.1 Western-blot31-38
• 3.2 RNA提取与RT-PCR38-42
• 3.3 转染-双荧光素酶报告基因实验42-43
• 3.4 HE染色及免疫组化43-46
• 3.5 空腹血糖、血脂测定与糖耐量试验46
• 3.6 ELISA法测定血清胰岛素水平46-47
• 3.7 小鼠原代肝细胞的分离与培养47-49
• 3.8 小鼠腹腔巨噬细胞的分离、纯化与培养49-50
• 3.9 小鼠原代Kupffer细胞的分离与纯化鉴定50-52
• 3.10油红O染色52-53
• 3.11统计学分析53
• 结果53-64
• 讨论64-66
• 结论66-67
• 参考文献67-75
• 综述75-86
• 参考文献81-86
• 致谢86

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