叉头蛋白FOXK2调控雌激素受体ERα的机理

发布时间：2017-09-22 12:37

  本文关键词：叉头蛋白FOXK2调控雌激素受体ERα的机理

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【摘要】：近年来,乳腺癌的发病率逐渐上升,严重影响女性的生活质量。研究表明,雌激素受体(estrogen receptors, ERs)在乳腺癌的发生发展过程中发挥重要作用。ERa是一种类固醇核受体,具有促进肿瘤细胞生长和存活的作用,已成为激素依赖的乳腺癌治疗的重要靶点之一。因此,鉴定对ERa功能具有调控作用的分子可以促进乳腺癌治疗策略的发展。FOXK2是一种叉头(forkhead box, FOX)蛋白转录因子。有研究表明,FOX家族的FOXA1和FOXO3a可以通过其保守的DNA结合结构域(FKH domain)和ERa相互作用,并调控其功能,而FOXK2也具有FKH结构域。因此,FOXK2蛋白对ERa的功能可能也具有调控作用。本研究从FOXK2与ERa的相互作用入手,探讨了FOXK2对ERa介导的基因转录的调控机理。本论文的主要工作如下：1.通过免疫组织化学实验和免疫印迹实验研究了FOXK2和ERα在乳腺癌中的相关性,发现FOXK2和ERa的蛋白水平在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中存在负相关。再使用FOXK2的全长和各缺失体,通过免疫共沉淀、哺乳动物细胞双杂和免疫荧光等实验,研究了FOXK2和ERa之间的相互作用。结果表明FOXK2通过其FKH结构域和ERa相互作用,这种相互作用发生在细胞核内。2.由于FOXK2ERα在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中的蛋白水平呈负相关,接下来通过免疫印迹实验检测了FOXK2对ERα蛋白水平的影响。结果表明FOXK2能够缩短ERa的半衰期,并以剂量依赖的方式下调ERa的蛋白水平,但不影响其mRNA水平。进一步的研究发现FOXK2是通过促进ERa的泛素化降解降低其蛋白水平的。3. BARD1是ERa泛素E3连接酶BRCA1/BARD1的一个亚基,通过免疫共沉淀实验发现,过表达FOXK2能够增强ERα与BRCA1/BARD1之间相互作用,而沉默FOXK2的表达能够减弱掉ERa与BRCA1/BARD1之间相互作用,表明FOXK2可以作为一个桥梁蛋白促进ERa与BRCA1/BARD1的结合,进而增强ERa的泛素化,导致其降解。4.进一步通过报告基因和Real-time PCR等实验,研究了FOXK2对ERa的转录活性及其靶基因mRNA水平的影响。实验结果表明FOXK2能够抑制ERa的转录活性,并下调ERa下游靶基因如Cyclin D1和GREB1的mRNA水平。5.最后,通过细胞集落形成、MTT以及流式细胞仪等实验检测了FOXK2对乳腺癌细胞功能的影响,发现FOXK2能够抑制ERα依赖的细胞增殖能力。本研究首次将FOXK2与ERα联系起来,确定FOXK2是ERa的一个有效的负调控因子,能通过ERa抑制乳腺癌细胞的增殖,有助于阐述ERa介导的乳腺癌发生发展的分子机理,为乳腺癌的治疗提供理论依据,为ERα介导的疾病的治疗开辟了新思路。
【关键词】：抑癌基因 癌基因 乳腺癌 FOXK2 ERα BARD1
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-21
• 缩略表21-23
• 1 绪论23-43
• 1.1 核受体ER的研究进展24-32
• 1.1.1 ER的发现24
• 1.1.2 ER的结构24-26
• 1.1.3 ER的转录26-31
• 1.1.4 ER与肿瘤的关系31-32
• 1.2 叉头蛋白FOX家族的研究进展32-40
• 1.2.1 FOX家族32-33
• 1.2.2 FOX蛋白的结构33-34
• 1.2.3 FOX蛋白的翻译后修饰34-37
• 1.2.4 FOX蛋白与肿瘤37-40
• 1.3 本论文的选题依据和研究内容40-43
• 1.3.1 选题依据40-41
• 1.3.2 研究内容41-43
• 2 FOXK2与ERα在乳腺癌中的相关性43-51
• 2.1 引言43
• 2.2 仪器与试剂43-45
• 2.2.1 仪器43-44
• 2.2.2 试剂44-45
• 2.2.3 乳腺癌样本45
• 2.3 实验45-47
• 2.3.1 免疫组织化学45
• 2.3.2 细胞培养45
• 2.3.3 蛋白样品制备45-46
• 2.3.4 Bradfold法测定蛋白浓度46
• 2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)46-47
• 2.3.6 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)47
• 2.4 结果47-50
• 2.4.1 FOXK2和ERα在人乳腺癌组织中的相关性47-49
• 2.4.2 FOXK2和ERα在人乳腺癌细胞系中的相关性49-50
• 2.5 讨论50
• 2.6 小结50-51
• 3 FOXK2与ERα之间的相互作用51-66
• 3.1 引言51
• 3.2 仪器与试剂51-54
• 3.2.1 仪器51-52
• 3.2.2 试剂52-53
• 3.2.3 菌种、细胞及质粒53-54
• 3.3 实验54-58
• 3.3.1 Flag-FOXK2截短缺失体质粒构建54-55
• 3.3.2 质粒转化55
• 3.3.3 用质粒小提中量试剂盒进行质粒提取55-56
• 3.3.4 酶切鉴定56
• 3.3.5 质粒测序56
• 3.3.6 细胞培养56
• 3.3.7 质粒转染56-57
• 3.3.8 蛋白样品制备57
• 3.3.9 Bradfold法测定蛋白浓度57
• 3.3.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)57
• 3.3.11 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)57
• 3.3.12 蛋白质免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)57
• 3.3.13 哺乳动物细胞双杂交(Mammalian two hybrid assay)57-58
• 3.3.14 免疫荧光(Immunofluorescence)58
• 3.4 结果58-64
• 3.4.1 内源FOXK2和ERα之间的相互作用58-60
• 3.4.2 外源FOXK2和ERα之间的相互作用60-62
• 3.4.3 FOXK2和ERα之间相互作用区域的确定62-64
• 3.4.4 FOXK2和ERα在MCF-7细胞中的分布64
• 3.5 讨论64-65
• 3.6 小结65-66
• 4 FOXK2对ERα蛋白水平的影响66-79
• 4.1 引言66
• 4.2 仪器与试剂66-68
• 4.2.1 仪器66-67
• 4.2.2 试剂67-68
• 4.2.3 菌种、细胞及质粒68
• 4.3 实验68-71
• 4.3.1 质粒提取68
• 4.3.2 细胞培养68
• 4.3.3 质粒转染68-69
• 4.3.4 蛋白样品制备69
• 4.3.5 Bradfold法测定蛋白浓度69
• 4.3.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)69
• 4.3.7 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)69
• 4.3.8 蛋白质免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)69
• 4.3.9 反转录PCR69-71
• 4.4 结果71-77
• 4.4.1 FOXK2对ERα蛋白水平的影响71-72
• 4.4.2 FOXK2对ERα mRNA水平的影响72-74
• 4.4.3 FOXK2对ERα蛋白降解的影响74
• 4.4.4 FOXK2对ERα蛋白稳定性的影响74-76
• 4.4.5 FOXK2对ERα泛素化水平的影响76-77
• 4.5 讨论77-78
• 4.6 小结78-79
• 5 BARD1在FOXK2调控ERα蛋白水平过程中的作用79-90
• 5.1 引言79
• 5.2 仪器与试剂79-81
• 5.2.1 仪器79-80
• 5.2.2 试剂80-81
• 5.2.3 菌种、细胞及质粒81
• 5.3 实验81-82
• 5.3.1 质粒提取81
• 5.3.2 细胞培养81
• 5.3.3 质粒转染81
• 5.3.4 蛋白样品制备81
• 5.3.5 Bradfold法测定蛋白浓度81
• 5.3.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)81
• 5.3.7 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)81-82
• 5.3.8 蛋白质免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)82
• 5.3.9 免疫荧光(Immunofluorescence)82
• 5.4 结果82-89
• 5.4.1 FOXK2与BARD1的相互作用82-84
• 5.4.2 FOXK2和BARD1相互作用结构域的确定84-85
• 5.4.3 FOXK2和BARD1在MCF-7细胞中的分布85-86
• 5.4.4 FOXK2对ERα与BARD1相互作用的影响86-87
• 5.4.5 FOXK2和BARD1对ERα泛素化水平的影响87-89
• 5.5 讨论89
• 5.6 小结89-90
• 6 FOXK2对ERα转录活性的影响90-102
• 6.1 引言90
• 6.2 仪器与试剂90-92
• 6.2.1 仪器90-91
• 6.2.2 试剂91
• 6.2.3 菌种、细胞及质粒91-92
• 6.3 实验92-94
• 6.3.1 质粒提取92
• 6.3.2 细胞培养92
• 6.3.3 质粒转染92
• 6.3.4 荧光素酶报告基因实验92
• 6.3.5 蛋白样品制备92
• 6.3.6 Bradfold法测定蛋白浓度92-93
• 6.3.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)93
• 6.3.8 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)93
• 6.3.9 反转录PCR93
• 6.3.10 实时定量PCR(Real-time-PCR)93-94
• 6.4 结果94-100
• 6.4.1 FOXK2对ERα转录活性的影响94-96
• 6.4.2 FOXK2缺失体对ERα转录活性的影响96-98
• 6.4.3 FOXK2对ERα下游靶基因mRNA水平的影响98-100
• 6.5 讨论100-101
• 6.6 小结101-102
• 7 FOXK2对ERα促乳腺癌细胞增殖功能的影响102-111
• 7.1 引言102
• 7.2 仪器与试剂102-103
• 7.2.1 仪器102
• 7.2.2 试剂102
• 7.2.3 细胞及质粒102-103
• 7.3 实验103-104
• 7.3.1 质粒提取103
• 7.3.2 细胞培养103
• 7.3.3 质粒转染103
• 7.3.4 细胞集落形成103
• 7.3.5 MTT检测细胞增殖103-104
• 7.3.6 流式细胞仪检测细胞周期104
• 7.4 结果104-109
• 7.4.1 FOXK2对ERα促乳腺癌细胞增殖能力的影响104-108
• 7.4.2 FOXK2和ERα对乳腺癌细胞细胞周期的影响108-109
• 7.5 讨论109-110
• 7.6 小结110-111
• 8 结论与展望111-113
• 8.1 结论111
• 8.2 创新点摘要111-112
• 8.3 展望112-113
• 参考文献113-127
• 作者简介127
• 攻读博士学位期间科研项目及科研成果127-130
• 致谢130

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本文编号：900876