Twist促进乳腺癌细胞能量代谢重塑的作用及相关机制研究

发布时间：2017-09-23 11:41

  本文关键词：Twist促进乳腺癌细胞能量代谢重塑的作用及相关机制研究

  更多相关文章： Twist 能量代谢重塑 乳腺肿瘤 迁移

【摘要】：目的：研究Twist对乳腺癌细胞能量代谢重塑的作用,以及能量代谢重塑对乳腺癌细胞迁移能力及EMT的影响,并进一步阐明其内在的分子作用机制,旨在为靶向肿瘤代谢的乳腺癌治疗策略提供新的理论基础。方法：体外培养MCF10A-Twist和MCF10A-Vector细胞,经常氧(21%02)和低氧(1%02)分别处理1 h、3 h、6 h、12 h后：采用葡萄糖测定试剂盒检测葡萄糖的消耗率；采用乳酸测定试剂盒检测乳酸的生成率；Mito-Tracker green探针法检测线粒体质量；透射电镜法检测线粒体的形态和数量。构建Twist基因干扰慢病毒载体,并建立稳定敲除Twist基因的MCF1 OA-Twist-sh-Twist细胞系和BT549-sh-Twist细胞系：检测葡萄糖消耗率及乳酸生成率；Mito-Tracker green探针法检测线粒体质量。利用生物信息学手段对本课题组前期的MCF10A-Twist和MCF10A-Vector的mRNA芯片和蛋白组学数据进行分析,筛选出能量代谢相关的差异基因；挑选差异基因进行qRT-PCR验证；Western Blot检测关键基因在常氧(21%02)及低氧(1%02)条件下的表达情况；Western Blot检测敲除Twist基因后关键基因的表达变化情况。WesternBlot检测关键基因在MCF10A和BT549中的表达情况；Western Blot检测BT549经低氧(1%02)处理6h后关键基因的变化情况；Western Blot检测BT549在敲除Twist基因后关键基因的表达变化情况。P13K特异性抑制剂LY294002分别作用MCF10A-Twist和MCF10A-Vector及BT549后(50μmol/L LY294002作用6 h),检测葡萄糖消耗率及乳酸生成率；采用Mito-Tracker green探针法检测线粒体质量；Western Blot检测关键基因的表达变化情况。对MCF10A-Twist和BT549采用siRNA沉默mTOR基因后,检测mTOR及下游代谢相关基因PKM2和LDHA的表达变化。在MCF10A-Vector中用siRNA沉默野生型p53基因,同时在MCF10A-Twist中过表达野生型p53基因,然后检测细胞中p53和G6PD的表达情况。Western Blot检测MCF10A (Twist不表达),MCF7(Twist低表达)和BT549(Twist高表达)细胞中p53和G6PD的表达情况。对BT549细胞用siRNA沉默内源突变型p53基因后,检测p53和G6PD的表达情况。在BT549细胞中过表达野生型p53基因后,检测p53和G6PD的表达情况。Transwell实验分别检测特异性抑制剂LY294002作用MCF10A-Twist和BT549后以及在MCF10A-Twist和BT549中过表达野生型p53后细胞迁移能力的变化情况,并采用Western Blot检测细胞中EMT标志物的表达变化情况。结果：在常氧或低氧条件下,MCF10A-Twist的葡萄糖消耗率和乳酸生成率均高于MCF10A-Vector,低氧处理增加了葡萄糖消耗率和乳酸生成率,且这种变化存在时间效应关系。与MCF10A-Vector相比,MCF10A-Twist的线粒体质量降低,且低氧处理进一步降低了线粒体质量,电镜下可见线粒体肿胀和纵型嵴等异常的线粒体形态。MCF10A-Twist重新敲除Twist基因后,葡萄糖消耗率和乳酸生成率降低,线粒体质量增加；敲低BT549细胞中内源性Twist基因表达后,葡萄糖消耗率和乳酸生成率降低,线粒体质量增加；低氧处理增加了葡萄糖消耗率和乳酸生成率,并使线粒体质量降低。对MCF10A-Twist和MCF10A-Vector的mRNA芯片和蛋白组学数据分析结果显示,MCF10A-Twist有10个与能量代谢相关的基因异常表达；qRT-PCR检测的mRNA表达结果与mRNA芯片及蛋白组学数据分析结果一致；Western Blot检测结果显示PKM2、LDHA、G6PD、pAKT表达上调,p53表达下调,低氧处理加剧了这一变化,且存在时间效应关系。MCF10A-Twist重新敲除Twist基因后,PKM2、LDHA、G6PD、pAKT表达下调,p53表达上调。与MCF10A细胞相比,BT549中PKM2、LDHA、G6PD、pAKT和p53表达均处于高水平；BT549经低氧处理后PKM2、LDHA、G6PD、pAKT和p53表达均上调；BT549在敲除Twist基因后PKM2、LDHA、G6PD、pAKT表达下调,p53表达上调。LY294002作用后,MCF10A-Twist不仅表现出葡萄糖消耗率和乳酸生成率降低,线粒体质量增加,而且pAKT、PKM2、LDHA的表达下调,但G6PD和P53的表达未见明显变化。MCF10A-Twist和BT549在沉默mTOR基因后,mTOR下游基因PKM2和LDHA表达均下调。MCF10A-Vector在沉默内源野生型p53基因后,G6PD表达上调；MCF10A-Twist中过表达野生型p53基因后,G6PD表达下调。WesternBlot结果显示G6PD表达水平从高到低依次为MCF7、BT549、MCF10A;p53表达水平从高到低依次为BT549、MCF10A,MCF7。BT549在沉默内源突变型p53基因后,G6PD表达无明显变化；BT549在过表达野生型p53基因后,G6PD表达下调。经抑制剂LY294002作用后,MCF10A-Twist和BT549的迁移能力均减弱,且EMT标志物E-cadherin表达上调,N-cadherin和Vimentin表达下调；MCF10A-Twist在过表达野生型p53基因后细胞迁移能力减弱,BT549在沉默内源突变型p53基因后或过表达野生型p53基因后细胞迁移能力均减弱,且细胞在恢复野生型p53基因表达后E-cadherin表达上调,N-cadherin口Vimentin表达下调。结论：在Twist高表达的乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞中,Twist能够通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路上调糖酵解途径关键酶PKM2和LDHA,同时通过抑制p53信号通路解除其对磷酸戊糖途径关键酶G6PD的抑制作用,从而促进能量代谢模式的转变,即从氧化磷酸化途径向糖酵解和磷酸戊糖途径的转变,使细胞发生能量代谢重塑,并为细胞的迁移及EMT等生物学过程提供能量和物质基础。
【关键词】：Twist 能量代谢重塑 乳腺肿瘤 迁移
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-18
• 前言18-20
• 1 材料与方法20-31
• 1.1 材料20-25
• 1.2 方法25-31
• 2 结果31-47
• 2.1 Twist引起MCF10A-Twist细胞能量代谢表型的改变31-34
• 2.2 Twist的表达缺失能部分逆转Twist引起的能量代谢表型改变34-36
• 2.3 MCF10A-Twist细胞和Twist阳性的乳腺癌细胞中能量代谢相关基因的表达36-41
• 2.4 Twist通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路和抑制p53信号通路诱导能量代谢重塑的发生41-45
• 2.5 Twist诱导的能量代谢重塑增强了MCF10A-Twist细胞和Twist阳性的乳腺癌细胞的迁移能力,并促进了细胞EMT过程45-47
• 3 讨论47-51
• 参考文献51-56
• 全文总结56-57
• 文献综述：肿瘤的能量代谢重塑57-70
• 参考文献64-70
• 致谢70-71
• 攻读博士学位期间撰写的学术论文71-73
• 攻读博士学位期间参与的科研项目73

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本文编号：905072