黄河鲤卵巢发育抑制性消减杂交文库的构建和相关基因的结构及功能分析

发布时间：2018-04-28 18:16

本文选题：黄河鲤鱼 + 抑制性消减杂交　；参考：《河南师范大学》2017年硕士论文

【摘要】：生物在其生命周期中,基因按时间和空间的顺序有序地进行表达,从而也决定了生命活动的多样性和复杂性。在鱼类性腺发育过程中,基因的时空表达方式也受到严格而精确的调控,不同的发育阶段,其表达基因各不相同。通过比较卵巢不同发育时期的基因表达差异,即可能寻找到与卵巢发育密切相关的基因,因此,本文选取黄河鲤不同发育时期的卵巢进行差异基因研究。本研究从mRNA水平上,分别以未分化性腺和二期卵巢为验证方(Tester),以成鱼卵巢为驱动方(Driver),构建抑制性消减杂交文库;利用Sorthern斑点杂交筛选后测序得到文库中的序列。借助GO信号通路分析其功能,从中选取与卵巢发育相关的候选基因,利用实时荧光定量qRT-PCR验证其表达。进而挑选Bmp基因进行详细研究,结合已有的黄河鲤转录组文库验证得到Bmp家族12个基因的cDNA序列,通过qRT-PCR分析其表达情况,挑选Bmp2、Bmp4和Bmp15进行深入研究。借助鲤鱼基因组信息对Bmp2、Bmp4和Bmp15所在染色体的基因结构、染色体同线性分析,通过组织原位杂交和免疫组织化学染色方法对其进行时空表达定位;利用Bmp信号通路抑制剂DSM体外处理性腺,初步探究Bmp信号通路对黄河鲤性别分化和早期卵巢发育的作用。研究主要成果如下:1.成功构建黄河鲤鱼未分化性腺和二期卵巢的抑制性消减杂交文库,经过转化摇菌,两个文库一共得到约1200个单克隆,用巢式PCR进行初步筛选,得到约600个含有插入片段的阳性克隆;之后借助Sorthern斑点杂交,进一步验证选出差异显著的150个克隆送公司测序。2.测序得到的序列进行生物信息学分析,在Genebank中进行Blast比对,除去重复和一些微卫星序列,两个库共得到78个unigene。GO分析文库基因的生物信号通路,分类分属17类,其中较多基因ESTs序列分属于蛋白质水解作用,信号转导、细胞分化和转化生长等。结合其基因功能分析和相关研究,选取与卵巢发育相关的22个候选基因(Bmp2,Pvalb,Mid1ip1l,Pax2,Zgc,Desmin,Bmp4等)进行文库验证,并对其功能进行初步分析。3.选取可能参与卵巢发育的Bmp家族基因,在黄河鲤鱼未分化性腺、幼鱼和成鱼雌雄性腺中对其表达模式定量分析,发现Bmp2、Bmp4和Bmp15分别在二期卵巢、未分化性腺和成熟卵巢中有高表达,故挑选Bmp2、Bmp4和Bmp15进行深入研究,验证得出Bmp2、Bmp4和Bmp15分别为2068、2037、2165的全长序列,各编码410、399和384个氨基酸,且羧基端均含有TGF-β结构域。分析基因Bmp4基因在基因组骨架上有一个重复出现,且其同线性分析染色体位置和其他物种差异较大。Bmp2和Bmp15分别位于黄河鲤第40号染色体和第5号染色体,同线性分析展示了和斑马鱼高度的进化相似性。4.原位杂交和免疫组化定位发现Bmp2、Bmp4和Bmp15三个基因表达位置相似,在二期卵巢中均集中在细胞质中表达,成熟卵巢时期集中表达在卵泡周围的皮质小泡中,结合其表达量推测Bmp2是黄河鲤卵巢早期发育的重要调控基因;Bmp15基因则作为卵泡早期生长调控基因可能参与黄河鲤卵巢中卵泡大小的发育。5.黄河鲤鱼未分化性腺中Bmp信号通路受到DSM成功抑制后,三个雄性标志基因(Amh,Dmrt1,Sox9a)在高浓度或者高剂量时出现显著或极显著表达上调,雌性基因Cyp19和Foxl2表达量显著降低,性腺在分子水平上出现偏向雄性分化的趋势,说明Bmp信号通路对于未分化性腺向雌雄分化起重要调节作用;对二期卵巢处理后也显示出抑制卵巢发育,故推测Bmp信号通路对于维持雌性卵巢早期正常发育有着重要的作用。综上所述,通过构建黄河鲤卵巢发育差异基因表达文库,从而找到与性别分化、发育等相关的基因,对于了解黄河鲤性腺发育的进程,深入详尽的知晓黄河鲤卵巢发育的分子机制有着非常重要的意义。同时为黄河鲤雌性发育控制机制的研究提供丰富的基因鉴定资源。
[Abstract]:In this paper , we studied the gene structure , chromosome and linear analysis of Bmp2 , BMP4 and Bmp15 in different developmental stages of the Yellow River carp . The results were as follows : 1 . The gene structure , chromosome and linear analysis of Bmp2 , BMP4 and Bmp15 were studied . The results showed that Bmp2 , BMP4 and Bmp15 were highly expressed in the ovary of the Yellow River . The results showed that Bmp2 , BMP4 and Bmp15 could be involved in the development of the ovarian follicles of the Yellow River .

【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

【参考文献】