桔小实蝇章鱼胺受体基因BdOctβ1R和BdOctβ2R的生理功能及药理学特性研究

发布时间：2018-08-13 19:33

【摘要】：桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel),隶属双翅目Diptera,实蝇科Tephritidae,是一类世界性的农业害虫,分布范围广,危害多种水果蔬菜。由于长期使用化学药剂防治,导致桔小实蝇的抗药性迅速发展,使传统的杀虫剂难以达到高效防控的目的。因此,寻找新的药剂靶标,开发新型药剂成为目前研究的重点。章鱼胺octopamine(OA)作为昆虫体内一种重要的生物胺,在昆虫体内参与调节多种重要的生理活动,偶联多种信号转导系统,与细胞内外第二信使的传递关系密切。章鱼胺主要通过与其受体结合,发挥各种功能。已有研究表明,章鱼胺受体作为一类典型的G蛋白偶联受体,是许多杀虫剂的潜在作用靶标。鉴于此,本学位论文研究根据桔小实蝇转录组筛选得到的4个章鱼胺受体基因,选取在其他昆虫中研究较为深入同时功能较为重要的2个β-adrenergic-like章鱼胺受体基因BdOctβ1R和BdOctβ2R,通过分析其分子生物学特性、药理学性质以及生理功能,评估作为新型药剂靶标的潜力,为桔小实蝇新型控制剂的开发提供新思路。主要研究结果如下:1.桔小实蝇BdOctβ1R和BdOctβ2R基因的cDNA克隆及序列分析通过分析和筛选桔小实蝇转录组数据库,结合RT-PCR克隆技术,成功获得了桔小实蝇章鱼胺受体基因BdOctβ1R和Bd Octβ2R的cDNA全长序列。利用TMHMM软件,预测推导的2个氨基酸序列的结构特征,发现这2个基因编码的蛋白序列都具有7跨膜结构,属于典型的G蛋白偶联受体。与已报道的模式昆虫果蝇、赤拟谷盗以及家蚕的β-adrenergic-like受体进行多序列比对,发现这2个基因序列具有相似的保守区域,同时表现出较高的同源性;通过与其他昆虫的章鱼胺受体的氨基酸序列进行系统发育分析,结果显示BdOctβ1R和BdOctβ2R与其他昆虫的β-adrenergic-like受体聚在一起,同源性较高,亲缘关系较近,因此,BdOctβ1R和BdOctβ2R属于β-adrenergic-like章鱼胺受体。2.桔小实蝇BdOctβ1R和BdOctβ2R基因的表达模式解析利用RT-qPCR技术,解析桔小实蝇BdOctβ1R和BdOctβ2R在不同发育阶段和不同组织中的表达模式。结果发现,BdOctβ1R和BdOctβ2R在桔小实蝇的各个发育阶段均有表达,其中在幼虫和成虫阶段具有较高的表达水平,从蛹期到成虫阶段,其表达量均为先降低后升高,并且分别在成虫的3日龄和7日龄达到最高。同时,检测这2个基因在桔小实蝇不同组织中的表达模式,发现BdOctβ1R和BdOctβ2R均在中枢神经系统(CNS)显著高表达,表明octopamine与中枢神经系统表达的BdOctβ1R和BdOctβ2R结合而发挥神经递质或神经调节的作用。饥饿胁迫能够显著诱导BdOctβ1R和BdOctβ2R的表达上调,尤其是BdOctβ1R的表达量发生显著上调,暗示BdOctβ1R和BdOctβ2R在桔小实蝇应对饥饿条件的生理活动中具有重要的调节作用。而在极端温度胁迫下,BdOctβ1R和BdOctβ2R的表达水平并未表现出明显的变化。3.桔小实蝇BdOctβ1R和BdOctβ2R基因的生理功能分析基于BdOctβ1R和BdOctβ2R在饥饿和不同温度处理后的表达模式,进一步利用RNAi技术探究Bd Octβ1R和BdOctβ2R在桔小实蝇应对饥饿胁迫以及繁殖等生命活动中的重要功能。结果表明,在对BdOctβ1R的沉默效率达到70%的情况下,RNAi后的桔小实蝇在饥饿处理中死亡率较对照虽有所升高,但并无显著差异,说明BdOctβ1R虽然参与调节桔小实蝇应对饥饿胁迫,但其并未直接起到调节作用。而对BdOctβ2R的RNAi效果不明显,注射dsRNA后基因沉默效率仅为27%,也未对桔小实蝇交配率和产卵量造成显著影响。4.桔小实蝇BdOctβ1R和Bd Octβ2R基因的真核表达及其药理学特性分析以pcDNA3.1质粒为重组载体,章鱼胺受体的模式配体octopamine能够有效地激活BdOctβ1R和BdOctβ2R,并且其激活能力呈浓度依赖性,EC50值分别是9.11×10 10和1.29×10 9 M,说明BdOctβ1R和BdOctβ2R均在HEK细胞中实现了功能性表达。进一步测定5种激动剂(octopamine、tyramine、naphazoline、dopamine和phentolamine)和3种拮抗剂(mianserin、phentolamine和chlorpromazine)对BdOctβ1R和Bd Octβ2R的活力。激动剂活性测定中,naphazoline是BdOctβ1R和BdOctβ2R特异性最强、效果最好的激动剂,tyramine展现了一定的激动效应,而dopamine对BdOctβ1R和BdOctβ2R的激动效应极弱。拮抗剂活性测定中,phentolamine对BdOctβ2R的拮抗效应强于BdOctβ1R,chlorpromazine对于两者的作用效果均较小。mianserin对于2个基因所表达的细胞内的cAMP反应都表现出较强的抑制作用,有明显的拮抗效应。综上所述,本研究在分析桔小实蝇转录组数据基础上,利用分子克隆技术获得了BdOctβ1R和BdOctβ2R基因的cDNA序列,为深入研究基因的功能提供了分子基础;利用生物信息学方法分析2个基因的序列结构以及系统进化关系,丰富了BdOctβ1R和BdOctβ2R基因的遗传信息;进一步利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术全面解析了BdOctβ1R和BdOctβ2R在桔小实蝇不同发育阶段、组织特异性表达模式及其在不同胁迫条件下转录水平的变化,为揭示其生理功能奠定基础;随后利用RNAi技术,初步明确了这2个章鱼胺受体基因在桔小实蝇体内所承担的重要生理功能;最后利用体外HEK细胞异源表达系统,成功表达了BdOctβ1R和BdOctβ2R,构建了桔小实蝇章鱼胺受体功能测定的平台,并分析了其药理学特性。研究结果将促进对桔小实蝇章鱼胺受体生理功能的认识,为构建桔小实蝇章鱼胺激动剂和拮抗剂筛选技术体系奠定基础,对开发以章鱼胺受体为靶标的新型杀虫剂具有重要的科学意义。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S433

【参考文献】