芥菜开花整合子SOC1与开花抑制因子SVP、FLC蛋白相互作用

发布时间：2018-12-07 18:14

【摘要】：开花是植物由营养生长转变为生殖生长的一个重要阶段,开花时间的时晚会影响产品器官的产量与品质。芥菜开花整合子SUPPRESSOR OF CO OVEREXPRESSION1(SOC1)、开花抑制因子FLOWERING LOCUS C (FLC)和SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP)均编码Type Ⅱ MADS-box型MIKC蛋白,在调控植株发育以及开花时间上起着非常重要的作用,但是它们调控芥菜开花时间的分子机制并不清楚。迄今为止,有关芥菜SOC1蛋白与SVP,FLC蛋白之间的作用机制仍未见报道。为了深入研究芥菜SOC1蛋白与开花负调控因子SVP及FLC蛋白互作的分子机理,本试验以‘青叶芥’为材料克隆了芥菜SOC1基因,构建了SOC1、SOC1突变体及SVP突变体的酵母双杂交重组表达载体和BiFC重组表达载体,并通过β-半乳糖苷酶活性测定了蛋白-蛋白相互作用强度,筛选并鉴定了SOC1分别与SVP, FLC蛋白的相互作用及其氨基酸作用位点。为深入研究SOCl在开花时间调控网络中的作用机理奠定了基础。主要试验结果如下：1. 芥菜SOC1基因的亚克隆及生物信息学分析以芥菜茎尖总RNA反转录cDNA第一链为模板,扩增得到SOCl基因的cDNA序列为639 bp,编码213个氨基酸残基,属于MIKC型蛋白,与油菜和埃塞俄比亚芥的SOC1亲缘关系最近。预测SOC1蛋白分子量大小为24.37 kDa,理论等电点为9.18。二级结构预测分析可知,芥菜SOC1蛋白中由氨基酸残基形成的α螺旋占整个氨基酸残基数56%,β折叠占10%,卷曲螺旋占34%。2.芥菜SOC1与SVP相互作用检测构建酵母表达载体pGBKT7-SOC1,通过醋酸锂转化法将重组质粒转化到感受态酵母中得到酵母转化子Y2HGold(pGBKT7-SOC1),经过毒性及自激活检测,发现无自激活和毒性现象。将Y2HGold(pGBKT7-SOC1)与本实验室提供的Y187(pGADT7-SVP)融合后,二倍体酵母Y187(pGADT7-SVP)×Y2HGold(pGBKT7-SOCl)能在选择型培养基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA(QDO/X/A)平板上长蓝色菌落。同时分别构建BiFC表达载体p2YC-SOC1和p2YN-SVP,通过冷热刺激法导入农杆菌GV3101中。将这两种菌液等量混合共浸润4-6片真叶的本氏烟,48 h后通过激光共聚焦显微镜在488 nm激发光下观察,发现共浸润含p2YC-SOC1和p2YN-SVP的本氏烟草表皮细胞周围发出黄色荧光。综上说明,开花信号整合子SOC1与开花负调控因子SVP存在蛋白相互作用。3.芥菜SOC1与FLC相互作用检测将Y2HGold(pGBKT7-SOC1)与本实验室提供的Y187(pGADT7-FLC)融合后,二倍体酵母Y187(pGADT7-FLC) X Y2HGold(pGBKT7-SOC1)能在选择型培养基SD/-Leu/-Trp/AbA (DDO/A)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)平板上长白色菌落、但是不能在QDO/X/A平板上生长。同时构建BiFC重组表达载体p2YN-FLC,通过冷热刺激法导入农杆菌GV3101中。确定阳性克隆后,将这种菌液与含p2YC-SOC1的菌液等量混合共浸润4-6片真叶的本氏烟草,48 h后通过激光共聚焦显微镜在488 nm激发光下观察发现,共浸润含p2YC-SOC1和p2YN-FLC的本氏烟草表皮细胞不发光。综上说明,开花信号整合子SOC1与开花负调控因子FLC不能相互作用。4.芥菜SOC1突变体与SVP相互作用检测分别构建SOC1V77K、SOC1P81K、SOC1K108V、SOC1R109L和SOC1C137K5个SOC1突变体,并构建pGBKT7-SOC1突变体酵母表达载体。通过醋酸锂转化法将重组质粒转化到感受态酵母中得到酵母转化子Y2HGold(pGBKT7-SOC1V77K), Y2HGold(pGBKT7-SOC1P81K), Y2HGold(pGBKT7-SOC1K108V), Y2HGold (pGBKT7-SOC1RI09L)以及Y2HGold(pGBKT7-SOC1C137K)。经过毒性及自激活检测,发现均无自激活和毒性现象。分别将这5个突变体的酵母转化子与Y187(pGADT7-SVP)融合,发现二倍体酵母Y187(pGADT7-SVP)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1V77K)、 Y187(pGADT7-SVP)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1P81K)能在缺陷培养基QDO/X/A平板上长蓝色菌落,而其他的融合菌落不能生长。同时分别构建SOC1突变体的BiFC表达载体p2YC-SOC1V77K、p2YC-SOC1P81K、 p2YC-SOC1K108V、p2YC-SOC1R109L以及p2YC-SOC1C137K,通过冷热刺激法导入农杆菌GV3101中。确定阳性克隆后,分别将每种菌液与含p2YC-SOC1的菌液等量混合共浸润4～6片真叶的本氏烟草,48 h后通过激光共聚焦显微镜在488 nm激发光下观察发现,共浸润含p2YC-SOC1V77K和p2YN-SVP、p2YC-SOC1P81K和p2YN-SVP的本氏烟草表皮细胞周围发出黄色荧光,其他组合不发光。5.芥菜SVP突变体与SOC1相互作用检测分别在SVP蛋白的K域构建4个SVP点突变(SVPE90L、SVPK104C、SVPH1061、SVPR137L),并构建pGADT7-SVP突变体酵母表达载体。通过醋酸锂转化法将重组质粒转化到感受态酵母中得到酵母转化子Y187(pGADT7-SVPE90L)、Y187(pGADT7-SVPK104C)、 Y187(pGADT7-SVPH1061)以及Y187(pGADT7-SVPR137L),分别将这4个突变体的酵母转化子与Y2HGold(pGBKT7-SOC1)融合,发现Y187(pGADT7-S VPE90L)、Y187(pGADT7-SVPK104C)、 Y187(pGADT7-SVPH1061)与Y2HGold(pGBKT7-SOC 1)的杂交组合能够在QDO/X/A平板上长蓝色菌落；二倍体酵母Y187(pGADT7-SVPR137L)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)不能在QDO/X/A平板生长。同时分别构建SVP突变体的BiFC表达载体p2YN-SVPE90L、p2YN-SVPK104C、 p2YN-SVPH1061及p2YN-SVPR137L,通过冷热刺激法导入农杆菌GV3101中。BiFC发现：共浸润含p2YC-SOC1和p2YN-SVPE90L、p2YC-SOC1和p2YN-SVPK104C、p2YC-SOC1和p2YN-SVPH1061的本氏烟草表皮细胞发出黄色荧光,其他组合不发光。6.互作强度分析酵母β-半乳糖营酶活性检测及方差分析表明：SOC1V77K、SOC1P81K突变体与SVP蛋白的作用强度均显著高于非突变体SOC1,其中SOC1P81K突变体又显著高于SOC1V77K;而SOC1的第108、109和137位氨基酸突变后(SOC1K108、SOC1R109L、SOC1C137K突变体)会导致SOC1与SVP的相互作用消失,说明SOC1的这五位氨基酸均能够调节SOC1/SVP的聚合强度。SVPE90L、SVPK104C、SVPH1061突变体与SOC1蛋白的作用强度均显著高于非突变体SVP,其中SVPK104C与SVPH1061之间差异不显著,但是它们显著高于突变体SVPE90L;而SVP的第137位氨基酸突变后(SVPR137L突变体)会导致SOC1与SVP的相互作用消失,说明SVP的这四位氨基酸均能够调节SVP/SOC1的聚合强度。另外,SOC1V77K×SVP、SOC1P81K×SVP杂交组合的作用均显著高于SOC1×SVPE90L、 SOC1×SVPK104C、SOC1×SVPH1061,说明SOC1第77位、81位氨基酸突变对SOC1/SVP聚合化的影响程度要显著高于SVP的第90、104、106位突变。利用SOC1蛋白K域的点突变来调节SOC1/SVP聚合化的效果很可能比SVP要明显。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2;S637

【参考文献】