青枯雷尔氏菌致病因子的分子特性及其调控研究

发布时间：2018-12-16 22:20

【摘要】：青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是世界十大重要植物病原物之一,因其分布范围广、寄主范围大且具有丰富的种内遗传多样性而被认为是一个多变的复合种(species complex)。目前,在我国青枯雷尔氏菌已有向高纬度高海拔冷凉地区逐渐蔓延之势。全基因组序列的获得为全面解释其在寄主识别、致病力变异、环境适应性以及群体进化等方面的特性提供了重要基础。长期以来,用于防治由该菌引起的植物青枯病的措施主要包括使用化学农药、培育抗性品种、生物防治以及农业防治等。由于化学药剂防治存在诸多问题,如效果不理想、污染环境等,目前有很多关于使用绿色、环保、有效的天然活性化合物来代替的报道。但是因该菌在环境中的多态性使得迄今为止仍未找到有效的防治药剂,造成的经济损失惨重。此外,不同药剂的长期使用是否会影响青枯雷尔氏菌的致病力发生变化也有待进一步研究。本论文在对代表青枯雷尔氏菌进行全基因组测序的基础上,分析了该菌株致病因子相关基因,并进一步比较了全国菌株致病基因变异情况。此外还探究了不同外源物质处理对菌株生长的影响及对致病力的调控作用,为研究种群多样性、致病因子变异等与生态适应性的关系提供基础,为今后青枯病的科学用药提供可靠的理论依据。本研究的主要结果如下:1.完成了青枯雷尔氏菌菌株CQPS-1的全基因组测序,并系统分析了致病因子的相关基因采用单分子实时测序技术(Single molecule real-time sequencing,SMRT)对青枯雷尔氏菌CQPS-1进行全基因组测序。组装后得到一条染色体(3.83 Mb)和一个大质粒(2.06 Mb),基因组GC含量为66.84%。共预测到5229个编码基因,并对基因进行了注释。将获得的基因组与菌株GMI1000、YC45、Y45、FQY_4、CFBP2957、PO82、CMR15和PSI07进行了比较基因组学分析,结果表明,菌株CQPS-1与4株演化型Ⅰ菌株(YC45、FQY_4、Y45、GMI1000)相比,有16个特有基因家族,共包括基因442个;与其他演化型菌株(CFBP2957、PO82、CMR15、PSI07)相比,有10个特有基因家族,共包括基因625个。与GMI1000相比,菌株CQPS-1的III型分泌系统(T3SS)基因簇较为保守,而且除部分III型分泌系统效应子基因(如RipAA,RipB和RipG7)存在一定差异外,其他致病相关基因均较保守。其中,效应子基因RipAA出现显著变异。2.比较了全国烟草青枯雷尔氏菌的致病因子相关基因,明确了各个致病因子相关基因的变异情况以菌株CQPS-1作为参考基因组,利用HiSeq 4000(Illumina)对全国烟草青枯雷尔氏菌的106株代表菌株进行基因组重测序,并分析菌株中致病相关基因的变异情况。结果表明,106个代表菌株基因组与参考菌株CQPS-1基因组比较共有约64,741个SNP,2,977个InDel,平均每个菌株获得371个SV变异。所分析的致病因子相关基因中,Ⅲ型分泌系统效应子基因相对于其他类的致病基因,存在更多类型的InDel突变,而与GMI1000相比差异最大的效应子基因RipAA的编码区域在全国烟草青枯雷尔氏菌中变异较小,仅存在一个SNP位点变异。3.测定了农用硫酸链霉素及东莨菪内酯对青枯雷尔氏菌的抑制生长作用和抑菌效果,明确了这些药剂对该菌致病力的影响采用平板带药法测定了外源物质对青枯雷尔氏菌的菌落生长情况,由结果可知,两种外源物质对青枯雷尔氏菌菌落的大小均有一定影响。利用浊度法确定了农用硫酸链霉素及东莨菪内酯的IC50分别为0.38 mg/L和133.87 mg/L,然后以此浓度分别制备带药培养基,对青枯雷尔氏菌CQPS-1进行长期的继代培养实验,观察其致病力变化情况。通过回接实验发现,农用硫酸链霉素继代培养30次和60次后,菌株的致病力在一定程度上有增强趋势:培养30次的菌株相较于清水处理菌株致病力有显著增强的趋势,继代培养60次的菌株相较于未处理菌株CQPS-1致病力有显著增强的趋势。而东莨菪内酯长期作用对菌株的致病力影响规律不明显:当东莨菪内酯继代培养30次时,虽相较于清水处理有增强的趋势,但是与溶剂对照相比无显著差异;当用东莨菪内酯继代培养60次时,与未处理菌株CQPS-1、清水对照菌株及溶剂对照菌株均无显著性差异。4.从分子水平上研究了农用硫酸链霉素及东莨菪内酯长期胁迫下青枯雷尔氏菌的致病相关基因的表达情况在农用硫酸链霉素长期处理过程中,菌株的核心转录调控因子phcA表现出显著上调的趋势,此外,胞外多糖合成相关基因在处理前期有一定程度的升高,但是处理后期差异不显著。东莨菪内酯处理前期,菌株的Ⅲ型分泌系统调节基因hrpG及关键毒力调节子基因pehS受到一定影响,而所选取的其他主要致病相关基因受到的影响不显著,当继代培养60次时,所有测定的致病基因变化均不显著。综上所述,本研究基于全基因组序列,分析了我国青枯雷尔氏菌致病相关基因的差异,发现了部分出现显著变异的基因,如RipAA,同时,从全国菌株致病因子相关基因的变异情况比较可知,与其他类的致病基因相比,Ⅲ型分泌系统效应子基因存在更多类型的InDel突变。外源物质农用硫酸链霉素及东莨菪内酯处理对菌株的生长均有抑制作用;不同外源物质长期胁迫对菌株致病力及致病基因表达存在差异。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S432.4

【参考文献】