猪IL-6对关键药物代谢酶CYP2C33的表达调控研究

发布时间：2018-12-17 10:05

【摘要】：细胞色素P450(cytochrome P450或CYP450)是由许多同工酶组成的人和动物体内重要的药物代谢酶超家族,涉及内源性和外源性物质以及几乎所有药物和其衍生物的代谢,另一方面,内源性物质以及外源性物质同样能够影响细胞色素P450酶的表达。CYP2C33是猪体内重要的药物代谢酶之一,是人CYP2C家族的研究模型。IL-6(interleukin-6)是一种引起肝脏炎症反应以及肿瘤病变最重要的细胞因子之一,且IL-6具有免疫调节作用,作为免疫佐剂和免疫增强剂被应用于畜禽养殖业中。但其对相关药物代谢酶表达的影响并不清楚,而药物代谢酶表达的变化严重影响临床药物的疗效、毒性作用以及药物与药物间的相互作用。本研究首次探讨猪IL-6对CYP2C33的表达调控及其相关的分子机制,为IL-6对CYP450表达调控研究提供理论基础,同时为兽医及临床医学上的合理用药提供理论指导。1.各种不同细胞色素P450在组织中的分布用qRT-PCR的方法检测不同组织中(心、肝、肾脏、小肠、肌肉、脾脏、皮肤、肺)细胞色素P450 m RNA的分布情况,结果显示,肝脏中CYP1A,CYP2C,CYP2D,CYP2E,CYP3A m RNA水平明显高于其他组织,而肝脏中含量最高的是CYP3A类药物代谢酶,其次则为CYP2C。该实验证明I相代谢主要集中于肝脏组织,因此后续实验在细胞水平研究细胞色素P450应在肝脏原代细胞水平和肝脏传代细胞水平研究。而在肝脏中含量最高的则是CYP3A类及CYP2C类药物代谢酶,这为后续的研究提供了一定的基础。2.原代猪肝细胞的分离培养利用不同方法获得了高活性的猪原代肝细胞,最终确定其最佳的方法为:采用PBE,PB,PBC三步灌流方法,最佳胶原酶灌流浓度为0.05%,最佳的包被方式为鼠尾胶原包被法。通过实验获得的猪肝细胞高达3X109个,存活率99.9%,细胞在培养5小时后开始贴壁分化,并在12小时细胞状态稳定,有较好的结构功能,通过测定相关药物代谢酶的m RNA水平与肝组织的较为相近,可用于IL-6的研究。3.IL-6在细胞水平对猪细胞色素酶CYP2C33表达的影响为了检测IL-6对猪细胞色素酶CYP2C33表达的影响,在不同时间点用不同浓度梯度的IL-6作用猪原代肝细胞和传代细胞系Hep Li,应用q RT-PCR和Western-blot的方法检测了肝脏细胞中IL-6对CYP2C33的表达量的影响,结果显示IL-6能显著性上调CYP2C33的表达,并呈现一定的时间和剂量相关性。4.IL-6从转录水平上对CYP2C33表达调控通过转录抑制实验,证明了IL-6是从转录水平上对CYP2C33的表达进行调控的。构建含有不同长度CYP2C33启动子的荧光素酶报告质粒,通过细胞转染不同长度的CYP2C33启动子片段,发现CYP2C33的核心启动子区域位于CYP2C33转录起始位点上游-2424到-1593区域,并且下游第一个内含子区域对上游启动子活性有一定的增强作用,通过用IL-6刺激其核心启动子区域,发现IL-6能激活CYP2C33的核心启动子区域。因此提示IL-6对CYP2C33的表达调控是从转录水平上对其发挥作用的。5.IL-6对核受体PXR,CAR,RXR-α表达的影响分别用不同浓度的IL-6在不同时间分别作用猪原代肝细胞和传代细胞系Hep Li,应用q RT-PCR和Western-blot检测了肝脏细胞中核受体PXR,CAR,RXR-α的表达量的影响,结果显示IL-6对RXR-α的表达并没有显著影响。而IL-6能显著性上调CAR和PXR的表达,CAR和PXR的变化趋势与CYP2C33变化趋势有相关性,且呈现一定的时间和剂量相关性。6.IL-6对CYP2C33表达机制的研究通过RACE的方法获得全长的RXR-α的序列,构建PXR,CAR以及RXR-α的真核表达质粒,用细胞转染PXR,CAR和RXR-α的真核表达质粒以及si PXR,si CAR,si RXR-α超表达或干扰相关核受体的表达,探讨IL-6上调CYP2C33表达的分子机制。结果显示:超表达PXR以及干扰PXR表达后,CYP2C33的表达并没有显著变化,而超表达CAR和RXR-α以及干扰CAR和RXR-α表达后CYP2C33的表达有相应的变化。因此提示IL-6上调CYP2C33表达与核受体CAR和RXR-α相关。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S859.7

【参考文献】