苦豆子瞬时转化体系的建立和SaLDC启动子功能分析

发布时间：2019-08-05 14:12

【摘要】：药用植物遗传转化体系的建立对其功能基因研究具有重要意义,本研究在已有苦豆子再生体系的基础上,分别对苦豆子愈伤组织的农杆菌(含pBI 121质粒)侵染浓度、侵染时间、愈伤组织与农杆菌的共培养时间、预培养时间、乙酰丁香酮(AS)添加方式和AS浓度进行研究,对这6个转化因子进行优化,探究各因素对苦豆子愈伤瞬时转化的影响,以确立最佳的苦豆子瞬时转化体系;在已有苦豆子赖氨酸脱羧酶基因(SaLDC)编码区的基础上,克隆得到该基因的启动子序列,并对获得的SaLDC启动子进行生物信息学分析;通过在苦豆子愈伤组织中的GUS瞬时表达对SaLDC启动子进行缺失分析,旨在确定该启动子的核心区域和研究不同缺失片段启动子对于下游基因的调控作用;农杆菌介导遗传转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株,以探索SaLDC启动子表达模式,为启动子顺式作用元件与相关转录因子的互作研究提供依据,研究结果如下:(1)建立并优化了苦豆子瞬时转化体系:预培养15 d的苦豆子愈伤组织,用菌液浓度A600=0.9农杆菌侵染15 min,农杆菌与愈伤组织共培养48 h,并在侵染液中添加AS 200 μmol·L-1时,瞬时转化效率最高,可达83.33%。(2)以苦豆子基因组DNA为模板克隆获得SaLDC上游1260 bp的启动子序列,提交至NCBI,GenBank登录号:KY038928。生物信息学分析发现该启动子片段含有基本顺式元件TATA-box和CAAT-box,以及其它响应外界刺激的顺式作用元件,包括生物响应元件:病原体响应元件;非生物响应元件:干旱响应元件、光响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、逆境防御应答元件、组织表达特异性元件等,表明SaLDC基因可能通过响应外界生物或非生物胁迫影响赖氨酸脱羧酶的表达。(3)将不同长度(310、594、765、924和1260bp)的启动子缺失片段分别与GUS报告基因融合,构建植物表达载体(依次命名为P310、P594、P765、P924和P1260),经农杆菌介导转化苦豆子愈伤组织,GUS瞬时表达结果显示,5个不同长度的SaLDC启动子片段均可驱动GUS基因在苦豆子愈伤组织中的表达,表明克隆所得的不同长度SaLDC启动子序列片段均具有启动活性,但表达水平具有显著差异,以310 bp启动子片段GUS瞬时表达强度最高,并随着SaLDC启动子片段长度的增加,GUS瞬时表达的强度逐渐下降。(4)对转基因(p1260)T2代拟南芥干旱和光照胁迫发现,SaLDC启动子为诱导型启动子,干旱和光照均可诱导GUS基因表达上调;:SaLDC启动子在转基因拟南芥中有效驱动GUS基因在叶片和花萼中优势表达,具有组织表达特异性:SaLDC启动子在转基因南芥幼苗期的不同生长阶段均可检测到GUS活性,但表达水平存在差异,表达水平随拟南芥的生长有下降趋势,具有时空表达特异性。
【图文】：

ＤＮＡ为模板扩增启动子序列，用１．０％琼脂糖凝胶电泳２）。逡逑Ｍ邋１逦２逡逑■逡逑２０００ｂｐ邋■寺邋ｐ邋Ａ邋（逡逑ｌＯＯＯｂｐ逦：；逡逑５００ｂｐ逡逑１邋ＯＯｂｐ—？邋Ｉ邋＾逦＾逡逑图３－２邋＆ＬＤＣ启动子琼脂糖凝胶电泳逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１、２：逦启动子片段逡逑序歹ＩＪ连接转化及测序逡逑Ｍ１２３４５６７８逡逑

苦豆子瞬时转化体系的建立和SaLDC启动子功能分析

第三章ＳａＬＤＣ启动子液体培养基，２８°Ｃ，，ＳＯＯｒｐｍ．ｍｉｎ－１，菌液，倒掉部分上清，轻弹离心管重的菌体涂布于附加５０邋ｍｇｌ－１卡那霉素培养４８邋ｈ；逡逑ＣＲ和双酶切验证。逡逑隆逡逑板扩增启动子序列，用１．０％琼脂糖凝Ｍ邋１逦２逡逑
【学位授予单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S567.23;Q943.2

【参考文献】