大花蕙兰转建兰花叶病毒与齿兰环斑病毒外壳蛋白基因及检测

发布时间：2019-08-15 07:50

【摘要】：大花蕙兰(Cymbidium hybridum)是以兰科兰属植物为亲本,通过杂交育种培育成的品种群,具有极高的观赏价值和重要的经济价值,为五大盆栽兰花之一,是重要的切花种类之一。近年来,世界多种兰花的栽培和生产受病毒危害严重,其中建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,Cym MV)与齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是造成危害最为严重的两种重要病毒,可导致植株生长不良、花期缩短,开花质量和数量下降,严重影响花卉的观赏价值,制约了产业发展。因此,培育大花蕙兰抗病毒新品种已成为育种的主要方向。由于兰花抗病毒种质资源的匾乏,育种周期漫长,导致兰花抗病毒育种一直处于停滞状态,基因工程技术的应用为其开辟了一条新的道路。本研究对建兰花叶病毒与齿兰环斑病毒的外壳蛋白基因进行了克隆,分别构建了2种病毒外壳蛋白基因的p BI121表达载体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法对大花蕙兰进行了转化,获得了转基因再生植株。同时,建立灵敏、准确的转基因植株检测方法。为利用基因工程技术进行兰花抗病毒育种提供了参考,为以后的兰花新品种培育提供了种质资源。1、本研究克隆了建兰花叶病毒与齿兰环斑病毒两种病毒的外壳蛋白基因,Cym MV CP基因序列和ORSV CP基因序列与NCBI上的基因序列(AB197937,DQ915440)相似度均高达99%。2、构建了Cym MV CP基因与ORSV CP基因的表达载体p BI121-Cym MVCP和p BI121-ORSVCP,通过农杆菌LBA4404介导对大花蕙兰受体材料进行了转化。3、以表达载体p BI121-Cym MVCP和p BI121-ORSVCP为模板,建立了普通PCR、巢式P CR和环介导等温扩增(LAMP)检测体系,并对LAMP体系中的d NTPs浓度、内外引物的浓度比例和Bst DNA聚合酶加入量等条件进行了优化。优化后的反应条件为:0.5mmol·L-1 d NTPs、0.8μmol·L-1的内引物、0.2μmol·L-1的外引物、4 U Bst DNA聚合酶大片段、2.5μL的10×Thermo Pol Buffer以及10 ng的质粒模板。4、以重组表达载体质粒作模板,普通PCR,巢式PCR和LAMP的最低检出浓度分别为5.0×10-4 ng·μL-1,5.0×10-7 ng·μL-1和5.0×10-10 ng·μL-1;结果表明,巢式PCR方法的灵敏度是普通PCR方法的1000倍左右,而LAMP方法的灵敏度则是巢式PCR方法的1000倍,LAMP方法的灵敏度最高。5、利用普通PCR和巢式PCR两种方法对获得的213株抗性植株进行检测。其中,普通PCR检出29株阳性株系,阳性检出率为13.68%;巢式PCR检出54株阳性株系(包含所有普通PCR检测为阳性的株系),阳性检出率为25.35%。巢式PCR在转基因大花蕙兰的检测中具有高灵敏度,且检测结果更准确。
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.8

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