椰果中产β-甘露聚糖酶内生细菌的筛选及酶学特性研究

发布时间：2019-09-19 15:43

【摘要】：β-1,4-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannanmann-ohydrolase,EC3.2.1.78),是一类能水解含β-l,4-D-甘露糖糖苷键的内切水解酶,属于半纤维素酶类。目前已有大量微生物产生β-甘露聚糖酶的相关报道,不过这些已经被报道的菌株大多是从海洋和土壤中分离得到的。自从邱德有等学者从云南红豆杉中分离出能够合成抗癌药物紫杉醇的内生真菌后,内生细菌的相关研究持续升温,但是主要集中在其药用价值和拮抗菌的筛选,关于内生细菌产酶的相关报道相对较少本研究尝试从海南特色植物椰果中筛选1-2株高产β-甘露聚糖酶内生细菌,并对其酶学性质、培养条件进行研究,为应用于水产动物饲料奠定理论基础。本研究共从椰果中分离得到56株植物内生细菌。所分离得到的内生细菌分布于5个目,5个科,9个属,19个种。在分离得到的56株菌中,芽孢芽孢杆菌属(Bacillus sp.)共34株,占总菌株数的60.71%,属于椰果内生细菌中的优势种群,其次是勒克菌属(Leclercia sp.)共8株,占总菌株数的14.29%,第三是嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas sp.)共5株,占总菌株数的8.93%。对分离的56株菌进行刚果红初筛和摇瓶发酵复筛发现菌株YZ-21酶活最高,可以达到20.67 U/mL,确定菌株YZ-21作为研究对象。经过测定胞外与胞内酶活比为37.97,证明该酶属于胞外酶。将YZ-21的16S rDNA测序结果通过NCBI进行BLAST,与Bacillus subtilis subsp.inaquosorum KCTC 13429T相似度为99.93%。YZ-21的形态特征、培养特征及生理生化指标测定等表型鉴定结果与东秀珠等《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》对枯草芽孢杆菌的描述基本符合,结合YZ-21的16S rDNA序列比对的结果,初步将YZ-21菌株鉴定为芽孢杆菌属细菌(Paenibacillus sp.)。对菌株YZ-21发酵条件进行优化,得出最优培养基为2%瓜豆胶、0.25%蛋白胨、0.2%K2HPO4、0.05%MgSO4、0.5%NaCl。最佳的培养条件为40℃,初始pH值7.0,200 r/min,发酵72 h,接种量为5%。优化过后的产酶水平能达到126.45 U/mL,约为初始酶活的5倍。本研究采用了乙醇沉淀法、硫酸铵盐析法和双水相三种方法对YZ-21所产酶进行分离纯化,最终确定双水相的最优盐种类为硫酸铵盐,16%PEG 2000和18%(NH4)2SO4双水相体系酶萃取率最高,能达到98.80%,之后添加不同浓度的NaCl,发现2%NaCl添加量能够使该酶萃取率上升至99.26%。对该酶的最适温度、pH进行测定,结果表明该酶的最适作用温度为40℃,最适pH为7.0。该酶在55℃条件下保温2 h之后,相对酶活依然能达到65.7%,在pH 5.0-8.0的条件下,保温30 min后,相对酶活依然可以保持在80%以上。Mg2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、K+这五种离子对于该酶具有激活作用,而酶激活作用最强的则是Ca2+,它能够使酶活相对于CK组提高了接近63.2%,Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Na+和EDTA均表现出了对该酶的抑制作用,其中Cu2+、Zn2+、Mn2+对该酶表现出明显的抑制作用。对菌株YZ-21基因组DNA进行PCR扩增,得到产β-甘露聚糖酶基因ManA,序列分析表明,该基因全长1127bp,该酶氨基酸序列与相同来源的β-甘露聚糖苷酶同源性最高能够达到97.56%,具有ManA保守结构域,属于糖苷水解酶家族GH26的一员。之后构建重组表达质粒pET-manA,将转入大肠杆菌BL21(DE),经过诱导获得了此酶的高效表达。对重组β-甘露聚糖酶酶活进行初步检测,结果显示,酶活力为372.86 U/mL。表达产物经过SDS-PAGE凝胶电泳分析,蛋白图谱显示一条大约为56.07 KDa的特异性条带。对重组酶酶学性质进行实验发现最适反应温度和pH分别为40℃和pH7.0,对重组β-甘露聚糖酶底物特异性进行实验,重组β-甘露聚糖酶最佳底物种类是瓜豆胶,其酶活能够达到392.54U/mL。重组β-甘露聚糖酶酶学性质研究表明,该菌所产的重组β-甘露聚糖酶最适反应温度和pH分别为40℃和7.0。该酶在35-55℃范围内酶活力较为稳定,55℃保温120 min后,酶活仍保留69.8%;pH 4.0-9.0保温30 min酶活均可保留60%以上,Ca2+、Co2+对重组β-甘露聚糖酶有明显的激活作用。
【图文】：

标准曲线,甘露糖,标准曲线,生长率

min 内生细菌生长率最高，能到达 100%，之后迅速下降，在 9 min 时，内生细菌的生长率已经降至 0。图2-1 甘露糖标准曲线Fig.2-1 Standard curve of mannose

植物内生细菌

充分研磨之后，静置 5 min，吸取上清进行涂布，观察是否有内生细菌生长果如图 2-2 所示。并将分离得到的内生细菌进行纯化，记录菌株形态特征如。4 内生细菌 16S rDNA 扩增结果对实验菌株进行 DNA 提取，，进行 16S rDNA 扩增，之后将扩增产物进行电泳泳结果如图 2-3 所示，将条带单一且亮度较强的产物送至南京金斯瑞公司测序
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S963

【参考文献】