利用基因组编辑技术创造油菜脂肪酸变异新资源

发布时间：2019-09-19 16:00

【摘要】：油菜是我国重要的油料作物之一。进一步提高油酸含量适当降低亚麻酸含量是油菜品质改良的重要内容,而获得高油酸和低亚麻酸资源是开展育种工作的基础。本研究利用CRISPR/Cas9技术,对控制油菜种子中油酸含量的FAD2及亚麻酸含量的FAD3基因进行定点编辑,并通过对转基因后代的连续自交和回交,获得了不带有转基因元件的高油酸低亚麻酸突变体。主要研究结果如下:1.对甘蓝型油菜FAD2与FAD3基因进行生物信息学分析,使用在线软件筛选出基因编辑靶点,构建了对油菜FAD2与FAD3基因靶点特异的CRISPR/Cas9植物表达载体。以农杆菌介导的下胚轴转化方法转化油菜品系J9707,获得了143株转FAD2靶基因和169株转FAD3靶基因转基因油菜。2.通过非变性PAGE胶检测了所有的转基因阳性植株,并挑选出部分突变单株进行了测序分析。本研究对FAD2靶基因的编辑效率为16%,而对FAD3的编辑效率为5%。FAD2突变体测序与靶基因核酸序列比对表明,单个碱基插入是主要的突变类型,占到各种突变类型的50%以上,同时还发现有2个至13个碱基缺失的多种突变类型。部分FAD3突变体测序结果检测到G-A碱基的替换和2个碱基AC的插入的突变。3.对FAD2基因在2个靶点各个拷贝突变效率进行了比较分析。针对第一个靶位点,BnaA.FAD2.a与BnaC.FAD2.a拷贝的突变效率为分别为53%和29%;而BnaA.FAD2.b与BnaC.FAD2.b拷贝虽然只在靶标序列的第一个碱基处有差异,前者的突变率为18%,BnaC.FAD2.b拷贝未检测到突变。统计结果还发现PAM序列对突变效率有较大影响。在第二个靶点位置,BnaA.FAD2.a拷贝的PAM序列为-GGG,突变效率为71%,然而PAM序列为-NGA的其他拷贝均未出现突变。4.突变单株自交及杂交后代基因型分析表明,杂合突变单株后代基因型的分离比符合孟德尔遗传规律。本研究在T0代没有编辑的阳性单株后代株系中检测到了突变单株,也观测到有些在T0代叶片中检测到突变不存在于种子的后代中;通过回交和自交能有效清除转化植株中的转基因成分。5.分析了转FAD2靶基因的突变单株在T1、T2和T3代种子各种脂肪酸含量。突变体种子中油酸含量显著提高,最高超过80%(野生型平均为66.43%),而亚麻酸含量显著下降。突变体中叶片的油酸含量与种子中油酸含量有显著的正相关。转FAD3靶基因的突变单株在T2代种子中亚麻酸含量显著下降。
【图文】：

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利用基因组编辑技术创造油菜脂肪酸变异新资源在后期要经过大量的筛选工作，并且编辑效率没有明显的提高（Terada et al 2002）。因此，传统的基因组编辑技术需要大量的人力与物力并且存在一定的安全问题不被人类普遍接受。近年来发展的人工核酸酶介导的基因组编辑技术则不同，这种技术理论上能够切除任何物种基因组的任何位置，从而能在内源性序列上引入特异性修饰。该技术与传统的基因组编辑技术最大的区别是能够将 T-DNA 从转基因受体中分离出来，得到不含转基因成分的突变体（Bassett et al 2013，Zhang et al 2014，Bassett et al 2015）。

油菜,脂肪酸,生物合成途径

CRISPR/Cas9 系统介导植物定点突变无论是单位点编辑、多位点的删除及置换都具有高效性和特异性，并且载体构建简便灵活。在农，利用 CRISPR/Cas9 系统能够快速实现基因定点突变和聚合某些优良育种提供更有效的方法。油菜脂肪酸改良及脂肪酸相关基因的研究进展油菜是不仅是我国重要的食用油和高蛋白饲料源，同时也是氢化油最理油菜的脂肪酸改良也主要是从不同的用途展开，，其中最受关注的一方籽油具有很好的热稳定性，在加热及存储过程中不易氧化，可以用来，清洁环保。油酸还能有效预防一些动脉硬化等疾病的发生，对人类要的作用（官春云 2006）。另外，菜籽油中的α-亚麻酸容易发生氧化产物会使油脂腐败变质并对人体健康产生不利影响（张正丽 2013）。肪酸改良与形成等相关机理成为了油菜的研究热点。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S565.4

【参考文献】