大豆霜霉病抗病相关转录因子WRKY的筛选及功能分析

发布时间：2019-09-20 04:43

【摘要】：大豆霜霉病是由专性寄生菌Peronospora manhurica(Naoun.)Sydow引起的真菌病害,严重威胁大豆生产,在世界各大豆产区均有发生,在我国东北和华北地区的发生尤其普遍,严重年份可减产30%～50%。本实验室在前期研究中发现,大豆丝氨酸/丙氨酸-乙醛酸转氨酶(GmS4GT1)基因的表达与大豆霜霉病抗性密切相关,高抗品种中GmS4GT1的平均表达量是高感品种的13倍,GmSAGT1在转录水平上参与大豆霜霉病抗性,抗、感品种中GmSAGT1的编码基因、酶学功能和启动子均差异微小。GmS4GT1启动子序列分析发现有2个转录因子WRKY的Binding site。已知WRKY是植物的重要转录因子,在多种植物的抗逆、抗病等生物过程起重要作用。迄今为止,WRKY转录因子与大豆霜霉病抗性相关性的研究尚未见文献报道。为此,本论文对大豆霜霉病抗病相关转录因子WRKY进行了筛选和研究,主要成果如下:1.以高抗和高感霜霉病的大豆品种为材料,分别提取接种和未接种霜霉病菌的大豆叶片RNA,进行转录组测序,分析接种前后WRKYs的表达量,发现7个WRKYs(WRKY5,WRKYY56,WRKY81,WRKY106,WRKY109,WRKY139 和 WRKY161)差异表达。接种后这7个基因在抗病品种中的表达量均高于感病品种,推测参与调控GwSA4GT1基因的表达和大豆霜霉病抗性。2.利用实时荧光定量PCR技术,对转录组测序结果进行验证发现,7个WRKYs基因在抗感病品种中的表达趋势与转录组测序结果一致,证明转录组测序研究结果可靠。3.为利用植物体内瞬时表达技术鉴定GwSAGT1启动子的活性,分别构建3个植物表达载体:1)以958bpGwSAGT1全长启动子G958,驱动GFP表达的植物表达载体pG958∷GFP;2)以GmS4GT1启动子3'端355bp核心区的G355驱动GFP表达的植物表达载体pG355∷GFP;3)以GmS4GT1启动子3'端181bp核心区G181驱动GFP表达的植物表达载体pG181∷GFP,转入拟南芥原生质体中,利用共聚焦激光显微镜观察发现,G958∷GFP、G355::GFP和G181∷GFP在拟南芥原生质体细胞中均有绿色荧光表达,G958∷GFP的表达最强,G355∷GFP和G181∷GFP的拟南芥原生质体细胞中的绿色荧光的亮度相当。表明3种启动子均具有启动基因表达的能力,可以用于酵母单杂交研究中诱饵载体的构建。4.利用酵母单杂交实验,对7个WRKYs基因进行筛选,发现WRKY5,WRKYY56,WRKY106,WRKY109,WRKY1 39和WRKY161均不能与GmSAGT1转录起始位点上游-235处和-272处的两个WRKY Bingding site(W-box)互作,WRKY81既能与GmSAGT1转录起始位点上游的W-boxl(TGACGTAC)结合也能与W-box2(GACTGAC)结合,表明WRKY81能够在转录水平调控GmSAGT1的表达,并参与大豆对霜霉病的抗性调控。本论文首次发现WRKY在大豆高抗高感中差异表达,与大豆对霜霉病的抗性密切相关,WRKY81通过与GmS4G71启动子上2个W-box的结合,调控大豆的霜霉病抗性。推测大豆受到病原菌刺激后WRKY81表达量首先上调,通过与GmS4GT1启动子结合,激活GmSAGT1基因表达,从而提高寄主植物叶片中活性氧含量,诱导超敏反应的发生,提高大豆对霜霉病的抗性。植物抗病反应是一个极其复杂的反应,它涉及多个网络和多种机理,本研究对揭示大豆霜霉病抗性的分子机理提供了一个良好的开端,具有重要意义。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S435.651

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本文编号：2538549