盐度胁迫下尼罗罗非鱼的能量代谢及其胆固醇营养的研究

发布时间：2020-04-07 04:50

【摘要】：尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)属于鲈形目、丽鱼科,因其生长性能优良、抗逆性强和营养丰富等特点,被广泛养殖。尼罗罗非鱼是淡水广盐性硬骨鱼类,经过盐度驯化的尼罗罗非鱼可以在32psu的盐度下生存(么宗利等,2003)。尼罗罗非鱼的咸水驯化不仅能够为扩大产量提供新的研究思路,还可以进一步揭示广盐性硬骨鱼类渗透压调节的奥秘。但是高盐度驯化会引发生长、增殖、发育等方面的问题。迄今,已经有大量的研究致力于探索尼罗罗非鱼在盐度驯化过程中生理生化水平的变化,但是还没有文献能够揭示整体的分子水平的响应,以及盐度驯化下的能量代谢概貌。本文以可能的硬骨鱼类的新型能量变化感应器—腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)为切入点,论证AMPK具有感应能量变化的功能,与此同时,揭示尼罗罗非鱼在急、慢性高盐驯化下能量物质的响应。此外,利用RNA-Seq技术确定了尼罗罗非鱼肝脏响应高盐度胁迫的代谢通路和基因。基于转录组分析结果,重点关注胆固醇相关的通路,并发现饲料中适宜水平的胆固醇能够通过调控HPI轴来达到缓解高盐度对罗非鱼胁迫的目的,为解决淡水硬骨鱼类在高盐环境中的不良反应提供了参考依据。主要结果如下:1.急性高盐胁迫对尼罗罗非鱼的AMPK表达和能量物质含量的影响腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)作为一种能量感应器在哺乳动物研究中引起了广泛的兴趣,其中α催化亚基的磷酸化对该酶的活性起决定作用。为研究鱼类中AMPK的基本信息以及是否同样扮演着能量变化感受器的角色,实验先以AMPKα亚基为代表,通过分段克隆、生物信息学和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)研究该基因在尼罗罗非鱼中的核酸序列,序列特性以及组织分布;随后对尼罗罗非鱼(10.92±1.25g)进行96h急性16psu盐度胁迫,以0psu组为对照组,在0h,6h,12h,24h,48h和96h依次取样,检测血清中的葡萄糖、乳酸和甘油三酯的含量,以及肝脏和肌肉中的糖原、乳酸、可溶性蛋白和AMPK的酶活力。结果显示,AMPKα亚基含有α1(1753bp)和α2(2563bp)两种亚型,分别编码571和557个氨基酸,分子质量分别是64 kDa和52 kDa。AMPKα1和AMPKα2共有的关键结构特征N-末端的TTr172位点与哺乳动物一致。并且,α亚基与其他鱼类物种以及脊椎动物的AMPKα亚基的同源性高达81.3%-98.1%,在组织中分布广泛。盐度胁迫实验结果显示,在16 psu组肝脏中,6h和24h时AMPK的活力显著高于0 psu组(P0.05),且16psu组的AMPK活力随时间的增加而升高,在24h处达到顶峰,随后活力下降并恢复到0 h 水平(P0.05)。肌肉中48h时AMPK的活力显著高于0 psu组(P0.05),两个组均呈现随时间先上升后下降的变化趋势。在16psu组中,12h时血糖水平显著高于0 psu组(P0.05),96h时乳酸水平显著高于0 psu组(P0.05)。相同时间点两组的甘油三酯含量没有差异,但均随时间的延长而降低(P0.05)。肌肉中,16psu组的乳酸在48h和96h处显著高于0psh组(P0.05),肌肉中两组的肌糖原含量未发生显著差异,但是均随时间的延长而显著降低(P0.05)。16 psu组肌肉中的可溶性蛋白浓度在12h处显著高于0psu组(P0.05)。两组肝脏中的肝糖原显著随时间增加而降低(P0.05),乳酸的浓度在6h,12h,24h和96h处显著高于对照组,且浓度随时间的增加而增加(P0.05)。以上结果为进一步研究AMPK在鱼体中的功能奠定研究基础,同时也证明AMPK在急性盐度胁迫下确实起着能量变化感受器的作用,为探索盐度胁迫下能量代谢的研究提供参考。2.慢性高盐驯化下尼罗罗非鱼的能量物质变化及肝脏转录组学的分析本实验旨在探究慢性盐度驯化对尼罗罗非鱼的能量物质含量和肝脏转录组的影响。随机将尼罗罗非鱼幼鱼(0.88±0.04 g)分成3个组,每个组3个平行,分别在0 psu、8 psu和16 psu的环境中养殖8周,用RNA-Seq的方法对肝脏的总RNA进行测序。基于差异基因的表达构建差异基因库,按照基因在3个盐度下的表达量将差异基因库中的差异基因分成3类:持续变化趋势;变化-不变趋势;不变-变化趋势。在持续变化趋势中,类固醇生物合成、类固醇激素生物合成、补体和凝血级联、脂肪消化和吸收发生显著的变化,表明上述通路与环境盐度变化有着密切的联系。在变化-不变趋势中,核糖体、氧化磷酸化、过氧化物增殖物激活受体的信号通路,以及消化和吸收通路都发生显著性变化,提示这些通路对环境的盐度变化具有很强的敏感性,且调控能力有限,所以具有一定的阈值。在不变-变化趋势中,蛋白质输出、内质网、紧密连接、甲状腺激素合成、抗原处理和呈现、糖酵解/糖异生和糖胺聚糖合成-硫酸角质素显著变化,表明这些通路在低盐度时足够调节机体的变化,但是当盐度超过一定阈值时,这些通路就会发生变化以维持机体的正常生理状态。本研究全面地揭示了在盐度驯化过程中尼罗罗非鱼mRNA分子层面的变化,通过上述分析,发现胆固醇参与的代谢通路可能在罗非鱼的能量适应中起着尤其关键的作用,也为今后更全面地理解和解决盐度胁迫提供研究基础。此外,分别检测0psu和16psu组血清中的葡萄糖、乳酸和甘油三酯的含量以及肝脏和肌肉中的糖原、乳酸和可溶性蛋白的含量。结果显示,16 psu组的血清、肌肉和肝脏的乳酸水平显著高于0psu组(P0.05),组织中的糖原显著低于0psu组(P0.05)。上述结果提示,在长期盐度胁迫中,尼罗罗非鱼需要花费更多的能量来维持正常的生理平衡。虽然罗非鱼的能量代谢已经重新进入了平衡状态,但是不完全的有氧呼吸还是使得体内的乳酸处于高水平状态。实验未发现AMPK的亚基的mRNA水平发生显著性变化,也证明AMPK只参与短期内的能量变化,在能量平衡后不起到关键调控作用。3.高盐度下尼罗罗非鱼饲料中胆固醇的营养作用研究根据转录组学的结果,在饲料中添加不同水平的胆固醇以探讨额外添加胆固醇是否对尼罗罗非鱼的盐度胁迫具有缓解作用及调节途径。选取规格相当的尼罗罗非鱼幼鱼(2.20 ± 0.12 g)随机分配成6个组,每个组3个平行缸,每个缸29尾。依次饲喂胆固醇含量为0%,0.4%,0.8%,1.2%,1.6%和2.4%的纯化饲料。在16psu环境中饲养8周,记录生长数据。检测血清和肝脏中的胆固醇、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和低密度脂蛋白(LDL-C)的含量;检测头肾的11β-羟基类固醇脱氢2(11β-HSD2)、20β-羟基类固醇脱氢酶2(20β-HSD2)和胆固醇侧链裂解酶P450(P450scc)和肝脏的糖皮质激素受体1(GR1)和GR2B的RNA水平,并且检测鳃丝的Na+/K+-ATP酶活性以及血清中皮质醇的浓度。结果显示,饲料中胆固醇添加量为0.4%时的增重率显著高于其他各组,饲料系数显著低于其他组(P0.05)。血清和肝脏中的胆固醇以及血清中LDL-C的水平随着饲料中胆固醇浓度的增加而上升(P0.05)。血清GSH随胆固醇增加而增加,SOD随之而减少(P0.05)。肝脏GSH随胆固醇的增加而降低(P0.05),SOD无明显变化。与0%组相比,其他组的头肾中P450scc的含量没有显著差异。11β-HSD2的mRNA水平在0%组最高,随胆固醇浓的升高而显著下降(P0.05)。20β-HSD2的mRNA水平在胆固醇浓度为0.4%和1.2%时显著高于其他组,在1.6%组中mRNA含量最低(P0.05)。当胆固醇浓度为0.8%时,GR1和GR2的mRNA含量最高(P0.05)。随着胆固醇含量升高,第二鳃弓的鳃丝中Na+/K+-ATP酶的活性先上升后下降,在0.4%组最高(P0.05)。血清中的皮质醇浓度随饲料中胆固醇水平的增加而升高,但当胆固醇含量超过0.8%时,血清中皮质醇的浓度不再上升(P0.05)。以上结果表明,在盐度胁迫下,胆固醇不是尼罗罗非鱼存活的必需品,但是可以作为饲料营养素添加剂。胆固醇通过HPI轴参与调控尼罗罗非鱼对半咸水环境的适应能力。饲料中添加低浓度胆固醇会对鱼体产生正面的效应,高浓度反而抑制。饲料中胆固醇含量为0.4%-0.8%最有利于罗非鱼咸水养殖。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

【参考文献】