球孢白僵菌pH响应转录因子BbPacC的功能研究

发布时间：2020-06-28 15:11

【摘要】：自然界中,真菌所处的环境的pH值一直处于不断变化之中,这种改变对真菌的生长、发育、次生代谢等生理活动具有非常重要的影响；为了生存和繁衍,真菌必须适应不断改变的酸碱环境。因而,研究真菌对酸碱环境的适应机理,是认知其生命活动规律的重要内容。本研究在昆虫病原真菌球孢白僵菌中,克隆了一个酸碱响应转录因子的编码基因BbPacC,通过表达特性检测、基因敲除、回复突变和超量表达等方法对该基因进行了功能分析,主要结果如下：1.BbPacC基因的克隆与表达特性通过同源克隆的方法获得BbPacC基因及其上下游序列共3990 bp(Genbank登录号：JX145340)。序列分析结果显示,该基因的DNA序列全长为1890 bp,包含2个内含子,其开放阅读框全长1773 bp,编码的蛋白含590个氨基酸,预测蛋白的等电点(PI)为8.2,分子量为63.5 kDa。通过对氨基酸序列比对发现,该蛋白分子与蛹虫草的PacC的同源性达到85%,推测该蛋白为球孢白僵菌的PacC同源蛋白。定量PCR结果表明,在球孢白僵菌生长发育的早期,BbPacC的表达受到抑制或处于很低的水平；随着时间延长进入中后期,其表达水平逐渐增加到较高的水平(8倍左右)。进一步研究发现BbPacC的表达受酸性条件的抑制,受盐碱条件的诱导,表明BbPacC与菌株盐碱胁迫相关。2.BbPacC对盐碱胁迫适应性的影响用CZA培养时,BbPacC敲除菌株在碱性(pH 8.0)及盐胁迫(1 M NaCl)条件下的生长明显减慢。通过对盐胁迫响应蛋白Na+/K+-P型ATPase的基因的启动子区域,进行DNA序列分析,结果显示该区域含有5个PacC特异识别位点；定量PCR也证实Na+/K+-P型ATPase基因的表达受BbPacC的调控。这些结果表明：BbPacC对菌株的营养生长具有负调节作用,并可能通过调节Na+/K+-P型ATPase基因的表达影响菌株的酸碱适应性及耐盐性。3.BbPacC对生长发育的影响BbPacC影响菌丝生长在营养贫瘠培养基(CZB)中,基因敲除菌株生长比野生菌株快,而超量表达菌株的生长却受到明显抑制。BbPacC影响分生孢子萌发和附着胞形成基因敲除菌株分生孢子(10.67 h)的萌发中时比野生型菌株(9.64 h)延长了1.03 h；观察附着胞形成率,发现基因敲除菌株比野生菌株下降了46.96%；表明BbPacC对孢子萌发和附着胞的形成具有正调节作用。BbPacC影响分生孢子的形成基因敲除菌株的产孢量比野生型菌株提高了107.34%,而超量表达菌株则下降了17.80%。通过对产孢关键基因fluG的启动子区域进行序列分析,结果发现该区域存在PacC蛋白的特异识别位点；并且该基因在BbPacC基因敲除菌株中的表达水平明显提高,比野生菌株增加近4倍。这些结果表明BbPacC可能通过负调节的方式调控fluG的表达,进而影响菌株的产孢。4. BbPacC对毒力的影响BbPacC影响菌株致死率通过体表侵染的方法,发现基因敲除菌株对大蜡螟幼虫的半致死时间LT50(123.99 h)较野生型菌株(97.89h)延长了26.66%,而超量表达菌株和野生菌株无明显差异,表明BbPacC基因参与对菌株的毒力的调节。BbPacC影响草酸的合成基因敲除菌株发酵液的草酸含量较野生型降低11.09%,而超量表达菌株草酸含量增加了125.00%。利用溴甲酚紫作为指示剂检测菌株生长代谢对培养基pH的影响,发现无论在1/4SDB还是在CZB中,基因敲除菌株所生长的培养基颜色均呈蓝色。测定pH显示,培养基因敲除菌株后的CZB培养基呈中性,而野生型和超量表达菌株的培养基呈酸性。在草酸的生物合成途径中存在两个重要基因草酰乙酸水解酶(OAH)和丙酮酸羧化酶(PYC)通过分别对两个基因启动子区域进行DNA序列分析,结果发现二者均含有PacC蛋白的特异结合位点。定量PCR结果显示,这两个基因在BbPacC超量表达菌株中的表达水平显著高于野生菌株,达到野生菌株的2-6倍。上述结果表明,BbPacC可能通过调节OAH和PYC基因的表达来影响菌株草酸的合成。BbPacC调节碱性丝氨酸蛋白酶基因Serp的表达利用脱脂奶粉作为检测底物观察菌落水解圈形成情况,发现基因敲除菌株菌落水解圈大小明显大于野生菌株,说明敲除BbPacC后,通过改变环境pH来诱导菌株分泌性蛋白酶基因的表达。通过对碱性丝氨酸蛋白酶Serp基因启动子区域进行DNA序列分析,结果发现该区域存在6个PacC结合位点,而且Serp基因在BbPacC基因敲除菌株中的表达水平明显提高,而在超量表达菌株中的水平明显降低。以上结果说明,BbPacC对碱性丝氨酸蛋白酶Serp等基因的表达具有间接调节作用。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476.1
【图文】：

质膜,锚定,内膜,高尔基体

逡逑ｅＭ／．，２００７）。Ｐａｌｌ如何协助ＰａｌＨ锚定在质膜的呢？有三种可能，如图１．２所示，（１）逡逑限制ＰａｌＨ的内吞：ＰａｌＨ可能通过内吞的方式到达内膜上，而Ｐａｌｌ为了保证内膜上逡逑ＰａｌＨ分子数量适中，会阻止过多ＰａｌＨ分子的内吞；（２）促进ＰａｌＨ的回收：Ｐａｌｌ逡逑协助ＰａｌＨ回到质膜上；（３）协助ＰａｌＨ脱离高尔基体：Ｐａｌｌ协助ＰａｌＨ以分泌囊泡逡逑的形式从高尔基体到质膜上。以上三种可能均需要ＰａｌＨ和Ｐａｌｌ有直接或间接的互逡逑作。逡逑曹逡逑＾Ｅｎｄｏｓｏｍｅ邋Ｖｊ邋Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ逡逑（ｋ逡逑Ｖ（邋Ｇｏｌｇｌ邋ｓｔａｃｋｓ逡逑ＴｔｉＬＮＯＳ邋ｔｎ邋Ｍｈ；ｒｏｂ＊ｏｔｃｇｙ逡逑图１．２邋Ｐａｌｌ促进Ｐａｍ锚定质膜的三种可能机制（Ｐｅｆｉａｌｖａ邋ｅｔａｌ．，邋２００８）．逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｐａｉｌ邋ａｓｓｉｓｔｓ邋ｔｈｅ邋ｐｌａｓｍａ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰａｌＨ邋ｂｙ邋ｔｈｒｅｅ邋ｐｏｓｓｉｂｌｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋（Ｐｅｎａｌｖａ邋ｅｔ邋ａ／．，逡逑２００８）．逡逑ｐＨ信号途径的内膜上存在转运必需的内体分选复合物（ＥＳＣＲＴ），Ａａｒｏｎ逡逑Ｍｉｔｃｈｅｌｌ团队在啤酒酵母中的研究，发现了邋ＥＳＣＲＴ－Ｉ型和ＥＳＣＲＴ－ＩＩ型的所有成分，逡逑以及邋ＥＳＣＲＴ－ｍ邋型的邋Ｖｐｓ３２ｐ￣Ｖｐｓ２０ｐ邋亚基（Ｘｕ邋ｅｔ邋ａｉ，邋２００４）＝邋Ｖｐｓ３２邋结合在内膜上，逡逑与邋ＥＳＣＲＴ－ＩＩ邋型、ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩ邋型的邋Ｖｐｓ２０邋相互作用（Ｔｅｏ邋ｅｔ邋ａｉ

静止培养,固体培养,麦角菌,鞭毛藻

逦１逡逑０．０５逡逑图４．１．２邋ＢｂＰａｃＣ与其它真菌Ｐａｃｅ同源蛋白的进化树分析图中进行比对分析的真菌分别为蜂绿僵菌（Ｍ逡逑ａｃｒｉｄｕｍ）、金龟子绿僵菌（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ邋ａｎｉｓｏｐＵａｅ）、稻曲菌（Ｖｉｌｌｏｓｉｄａｖａ邋ｖｉｒｅｎｓ）、麦角菌（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓｐｕｒｐｕｒｅａ、、逡逑深绿木霉（７！邋ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、哈茨木霉（７！邋ｈａｒｚｉａｎｕｍ）＾鞭毛藻丛赤壳菌邋（Ｎｅｃｔｒｉａ邋ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ、、邋尖孢镰刀菌逡逑｛Ｆｕｓａｒｉｕｍ邋ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、、轮状镰刀菌ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）和稻瘟菌（Ｍ邋ｏｒｙｚａｅ）ｙ黑色框表示球抱白僵菌（５．逡逑ｂａｓｓｉａｎａ）？逡逑Ｆｉｇ．邋４．１．２邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ＢｂＰａｃＣ邋ａｎｄ邋ＰａｃＣ邋ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｆｒｏｍ邋ｏｔｈｅｒ邋ｆｕｎｇｉ．邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ逡逑ｃｈａｒｔ邋ｗｅｒｅ邋ｆｒｏｍ邋Ｍ．邋ａｃｒｉｄｕｍ，Ｍ邋ａｎｉｓｏｐｌｉａ’邋Ｖ．邋ｖｉｒｅｎｓ，邋Ｃ．邋ｐｕｒｐｕｒｅａ，邋Ｔ．邋ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ，邋Ｔ．邋ｈａｎｉａｍｍ，Ｎ．邋ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ，Ｆ．逡逑ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，Ｆ．邋ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅＳｙ邋Ｍ．邋ｏｒｙｚａｅ，邋ｔｈｅ邋ｂｌａｃｋ邋ｂｏｘ邋ｒｅｆｅｒｒｅｄ邋ｔｏ邋Ｂ．邋ｂａｓｓｉａｎａ．逡逑４．２邋ＢｂＰａｃＣ的表达特性检n,逡逑在２６°Ｃ，用ＳＤＡ培养，检测球孢白僵菌在生长和产孢过程中ＢｂＰａｃＣ的表达逡逑情况，发现该基因的表达水平在菌株生长的早期（３ｄ）较低，随着时间的延长（６逡逑ｄ、９（１、１２邋ｄ）而逐渐增加

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