金钱鱼促性腺激素基因的克

发布时间：2020-07-05 03:01

【摘要】：在脊椎动物中,性腺的发育和配子的形成及成熟主要受脑或下丘脑-垂体-性腺轴(BPGHPG)的调节。脊椎动物下丘脑分泌的促性腺激素释放激素,使垂体分泌促性腺激素(gonadotropin hormones,GtH),即促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)作用于性腺,诱导并调控配子的形成。硬骨鱼类中,FSH和LH对生殖调控功能的实现依赖于跟它们的受体相结合,启动下游信号传导通路以及激活相关蛋白并诱导性激素的合成并且作用于配子的成熟及排放。本文以实验室暂养的金钱鱼(Scatophagus argus)为研究对象,运用基因克隆技术、原核表达系统、组织学方法、实时定量荧光PCR、酶联免疫测定(ELISA),对金钱鱼的促性腺激素基因进行克隆与序列分析、原核表达重组载体的构建、重组蛋白的获得及利用、注射和投喂处理后相关基因的表达、以及血清中性类固醇类激素含量的变化进行了研究及分析。本研究相关结果如下:(1)目的基因的克隆:设计引物并利用基因克隆技术克隆金钱鱼LH和FSH的cDNA全长序列的克隆。金钱鱼FSH基因全长542bp,ORF为363bp,其编码120个氨基酸。金钱鱼LH的基因全长608bp,ORF框为438bp,其编码145个氨基酸。将金钱鱼FSH和LH氨基酸序列与其它鱼类进行同源性比较,系统发育树结果表明,金钱鱼FSH和LH的进化地位与物种分类的地位是一致的,在进化过程中比较保守。(2)重组蛋白的构建:构建GtH与载体pET-28a的重组质粒,在经优化后的原核表达条件下,诱导表达获得可溶的重组FSH和LH融合蛋白。经过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,Western Blot检测得到纯化的FSH和LH重组蛋白,随后进行金钱鱼注射及青淏(Oryzias latipe)投喂实验。(3)性腺组织学的观察:对实验对象金钱鱼和青淏分别进行注射和投喂试实验,然后依照组织学观察方法分别进行了扫描式电子显微镜(scanning Electron Microscope,SEM)和苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)观察。经注射处理后,扫描隧道电镜观察发现实验组金钱鱼较对照组与空白组而言,卵巢中卵母细胞分化及成熟度较对照组更高。精巢中大部分精母细胞分化为支持细胞和精子,且精子成熟度较高。经投喂处理后,组织学切片观察发现,实验组青淏较对照组与空白组而言,卵巢中卵子成熟度较高,卵黄颗粒发育成熟。精巢中,精子细胞基本完全成熟,且部分已经排出。(4)相关基因的表达分析:利用相对实时荧光定量PCR技术对金钱鱼生殖轴相关基因,促性腺激素受体(gonadotropin hormone receptor,GtHR),抗缪勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,Amh),类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,Star),17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase,17β-hsd)等在金钱鱼性腺组织中不同表达情况进行研究。经重组GtH注射后,SaFSHR和SaLHR表达量显著升高(p0.05,p0.01),Amh表达水平显著下降(p0.05),Star和17β-hsd表达升高(p0.05,p0.05)。(5)类固醇类激素的测定:采用酶联免疫测定法对金钱鱼血清中性类固醇类激素,即雌二醇(Estradiol-17β,E2)和11-酮基睾酮(11-keto Testosterone,11-kT)分别进行浓度测定,分别如下:雌性中,E2浓度分别约为312.77 pg/ml(0 dpt),337.90 pg/ml(7 dpt))和474.57 pg/ml(14 dpt),呈现上升趋势(p0.05)。雄性中,11-kT浓度分别约为70.88 pg/ml(0 dpt),65.67 pg/ml(7 dpt)和135.65 pg/ml(14 dpt),浓度变化明显升高(p0.01)。本研究初步阐述了金钱鱼GtH对其HPG生殖轴的调控机制,结果表明FSH和LH激活类固醇合成过程,促进的相关基因GtHR,Star,17β-hsd的表达,进而调控性类固醇激素E2和11-kT的生物合成,并作用于性腺发育和配子发生。另外,抑制Amh的表达以促进雌二醇(estradiol,E2)和11-酮基睾酮(11-keto Testerone,11-kT)的生物合成使得卵黄发生和配子形成。研究结果为揭示金钱鱼繁殖调控的内分泌机制提供了初步的基础资料,并且获得一种可能促进鱼类性腺发育的蛋白饲料添加剂,旨在将来为水产养殖行业做出贡献。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

【参考文献】

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本文编号：2741985