水稻两个miRNA靶基因功能分析载体的构建及遗传转化

发布时间：2017-03-31 03:23

  本文关键词：水稻两个miRNA靶基因功能分析载体的构建及遗传转化，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：稻瘟病作为水稻三大病害之一,是严重影响水稻生产的重要病害。目前研究表明,植物中的miRNA可以调控植物的生长发育,生物和非生物胁迫,以及抗性反应。但是其中针对miRNA调节水稻和稻瘟病菌互作的研究报道很少,本实验室鉴定出了两个正调稻瘟病抗性的miRNA:miRNA398和miRNA 160,并且他们可能是通过抑制靶基因的转录来调控稻瘟病抗性。为了研究miRNA 160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410的生物学功能,验证靶基因LOC_Os06g47150与-niRNA160的关系、靶基因LOC_Os04g48410与miRNA398的关系,并进一步阐释miRNA398和miRNA 160的调控网络的研究做准备。本课题通过构建niRNA160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410过表达载体,过表达突变载体,以及RNAi载体,并遗传转化水稻获得了相应材料。本研究中,首先是构建miRNA 160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410过表达载体,通过注射本生烟观察这两个基因的亚细胞定位,发现靶基因LOC_Os04g48410主要在细胞膜上表达,而靶基因LOC_Os06g47150主要在细胞核中表达。其次是构建miRNA 160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410过表达突变载体,并通过农杆菌介导方法转化水稻,经潮霉素鉴定和PCR鉴定后,LOC_Os06g47150mutant得到了4株转基因水稻植株,LOC_Os04g48410 mutant得到24株转基因水稻植株。最后构建了miRNA 160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410 RNAi的载体。
【关键词】：水稻 靶基因 突变体 RNAi 转基因
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S511
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-8
• 符号说明8-9
• 1 文献综述9-25
• 1.1 植物的抗病性9-16
• 1.1.1 病原相关分子模式所激发的免疫反应(PTI)10-11
• 1.1.2 效应因子激发的免疫反应(ETI)11-12
• 1.1.3 植物获得性抗性(SAR)12-13
• 1.1.4 水稻中与稻瘟病相关的先天免疫反应13-16
• 1.2 RNA干涉技术研究16-21
• 1.2.1 RNAi的作用机理17-19
• 1.2.2 RNAi的技术特点19-21
• 1.3 MicroRNA的研究进展21-24
• 1.3.1 MicroRNA的发现21
• 1.3.2 MicroRNA的合成21-23
• 1.3.3 MicroRNA的作用机制23
• 1.3.4 MicroRNA在植物中的作用23-24
• 1.4 论文选题依据及研究的目的意义24-25
• 2 材料与方法25-36
• 2.1 实验材料25-27
• 2.1.1 水稻材料25
• 2.1.2 遗传转化体系中菌株和质粒载体25
• 2.1.3 分子生物学试剂25-26
• 2.1.4 主要实验仪器设备26
• 2.1.5 培养基及其抗生素26-27
• 2.2 实验方法27-36
• 2.2.1 水稻材料培养27
• 2.2.2 水稻DNA提取27
• 2.2.3 水稻总RNA提取,反转为cDNA27-29
• 2.2.3.1 水稻总RNA提取的准备27
• 2.2.3.2 水稻总RNA提取步骤27-28
• 2.2.3.3 RNA纯化及反转录28-29
• 2.2.4 相关克隆载体的构建29-33
• 2.2.4.1 目标基因的克隆及回收纯化29-30
• 2.2.4.2 大肠杆菌感受态的制备30
• 2.2.4.3 大肠杆菌的转化30-32
• 2.2.4.4 农杆菌感受态的制备32
• 2.2.4.5 农杆菌的转化(电转)32
• 2.2.4.6 农杆菌的菌落PCR检测32-33
• 2.2.5 本生烟瞬时表达33
• 2.2.6 农杆菌介导的水稻遗传转化33-35
• 2.2.6.1 主要涉及的培养基33-34
• 2.2.6.2 水稻愈伤组织的诱导34
• 2.2.6.3 转化愈伤组织34-35
• 2.2.7 对遗传转化产生的水稻植株进行阳性鉴定35-36
• 2.2.7.1 潮霉素初筛35
• 2.2.7.2 水稻转基因植株经行PCR鉴定35-36
• 3 结果与分析36-45
• 3.1 miRNA160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410过表达载体的构建及亚细胞定位37-40
• 3.1.1 载体构建37-38
• 3.1.2 亚细胞定位38-40
• 3.2 miRNA160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410过表达突变体载体的构建40-41
• 3.3 miRNA160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410RNAi载体的构建41-42
• 3.4 农杆菌介导的水稻遗传转化42-45
• 3.4.1 转化42-43
• 3.4.2 鉴定43-45
• 4 讨论45-47
• 参考文献47-55
• 致谢55-56
• 附录56-59
• 附表1.引物59-60

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